[发明专利]一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法

说明书

本发明提供了一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤1，神经节的消化分离：步骤1‑1，把SD小鼠的后背剪开并将神经节细胞剥离，步骤1‑2，将神经节冲洗、剪碎；步骤1‑3，加入消化液并在37℃的摇床中低速旋转进行消化，然后离心弃去消化液后加入贴壁培养基，吹匀得到悬浮液；步骤2，迷走神经元的培养：步骤2‑1，使用70μm过滤器对悬浮液进行过滤，步骤2‑2，用贴壁培养基将滤液稀释后接种到6孔板中，10万个细胞/孔，步骤2‑3，放入培养箱中培养，并用差速贴壁法去除非神经细胞，8小时后，更换成生长培养基，继续培养细胞4‑6天，得到培养好的迷走神经元细胞。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法。

背景技术

迷走神经在大脑和外周器官之间提供双向信息传递，并通过介导肠脑交流在能量代谢调控中发挥重要作用。其中，70％的迷走神经纤维来自胞体，并位于结状神经节(nodose ganglion,NG)的迷走神经传入神经元(vagal afferent neurons,VANs)，其神经末梢与肠道形成以下三种连接：平滑肌内神经节内板状末梢和肌内阵列、粘膜内轴突末梢、与肠道内分泌细胞形成快速兴奋性突触。VANs既能直接感受肠道牵拉、收缩等机械刺激，还通过受体对GM(XX)产物、肠道激素以及神经递质等化学信号做出反应，是能量代谢和糖脂代谢调控的主要神经机制。

不同营养状态下的迷走神经传入神经元的神经化学表型是可塑的，参与维持机体能量平衡的重要机制，在代谢稳态的调控以及肥胖的发生中都发挥重要作用。因此，培养肥胖小鼠的迷走神经元细胞是研究VANs功能的基础。然而现有技术中，有关迷走神经元原代培养的报道较少，没有比较合适的方法对迷走神经元进行原代培养，这极大地制约了对VANs功能地进一步研究。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法。

本发明提供了一种袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤1，神经节的消化分离步骤，该步骤包括以下子步骤：步骤1-1，把肥胖培养的SPF级Sprague-Dawlcy小鼠的后背剪开，并借助解剖显微镜，用镊子将神经节细胞剥离，步骤1-2，将剥离的神经节用Hanks盐平衡溶液进行冲洗，并将清洗后的神经节剪碎得到剪碎的组织；步骤1-3，向剪碎的组织加入消化液并在37℃的摇床中低速旋转进行消化，然后离心弃去消化液后加入贴壁培养基，吹打均匀得到悬浮液；以及步骤2，迷走神经元的培养步骤，该步骤包括以下子步骤，步骤2-1，使用70μm过滤器对悬浮液进行过滤，得到滤液，步骤2-2，用贴壁培养基将滤液进行稀释后接种到6孔板中，10万个细胞/孔，轻轻混匀细胞，使细胞均匀铺在培养皿中，步骤2-3，将培养皿放入培养箱中培养，在培养过程中使用差速贴壁法去除非神经细胞，8小时后，弃掉贴壁培养基并更换成生长培养基，继续培养细胞4-6天，每两天更换新鲜的生长培养基，得到培养好的迷走神经元细胞。

在本发明提供的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤1-1中，Sprague-Dawlcy小鼠是取自新出生30～40天、体重30～40g的，并且雌雄不限。

在本发明提供的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤1-3中，剪碎的组织与消化液的质量体积为(0.2g～1g)：2ml。

在本发明提供的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤1-3中，消化液为质量体积浓度为0.25％的胰蛋白酶。

在本发明提供的袖状胃切除小鼠迷走神经的原代细胞培养方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤1-3中，消化液包括体积比为1:1的胰蛋白酶和I型胶原酶，胰蛋白酶的质量体积浓度为0.25％，I型胶原酶的质量体积浓度为0.2％。