[发明专利]一种精准定量的CUT＆Tag文库制备方法及试剂盒

说明书

本申请提供一种精准定量的CUTTag文库制备方法及试剂盒，主要包括：提供两种衔接子，第一衔接子为5`‑S1‑S2‑S3‑3`，第二衔接子为5`‑S4‑S5‑S6‑3`，其中，所述S1为第一测序引物，S2为随机标签序列，S2的碱基为A、T、G、C中的一种或多种的随机组合，S2的碱基的数量为1‑95的任一整数，所述S3与S6的碱基序列相同、为Tn5转座子固定序列，S4为第二测序引物，S5为随机标签序列，S5的碱基为A、T、G、C中的一种或多种的随机组合，S5的碱基的数量为1‑100的任一整数；将所述两种衔接子与pA‑Tn5酶进行孵育得到转座复合体；再将转座复合体与测试样本进行孵育，得到扩增模板；将所述扩增模板进行PCR扩增，得到测序文库。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种精准定量的CUTTag文库制备方法及试剂盒。

背景技术

基因表达调控在多细胞生物的生长和发育中起关键作用。基因组调控，包括DNA甲基化，组蛋白修饰，转录因子及蛋白质复合物的差异结合，导致不同组织和不同发育时期的基因表达差异。目前用于研究染色质组分的方法有：1.ChIP(ChromatinImmunoprecipitation染色质免疫共沉淀技术)，是研究蛋白质与DNA相互作用的有效方法，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。但是该方法操作繁琐、时间长(3-4天)，需要大量的细胞用于实验(一千万细胞)，交联会引起的表位掩盖，DNA产量低并且背景高。2.ChEC(染色质内源切割)ChIC(染色质免疫切割)。这两种方法都是将无活性的微球菌核酸酶(MNase)与感兴趣的染色质蛋白结合，然后激活MNase裂解DNA，进行建库测序分析。但该方法引入了甲醛固定操作，会引起表位的掩盖。3.CUTRUN(cleavage under targets and release using nuclease)，该产生的背景低，可以从至少1000个细胞中生成高质量的数据。但是该方法操作繁琐，成本高，时间长且不是十分适合应用于单细胞平台。4.CUTTag(在标靶和标签下裂解)，使用Tn5转座酶与蛋白A的融合蛋白(pA-Tn5),将其与抗体结合，激活pA-Tn5导致靶向因子标记，产生DNA测序片段。该方法不受交联引起的表位掩盖影响；产生的片段具有低背景的信号；实验时间短，仅需一天就可以完成实验。并且该过程高度灵敏，只需要100-100000个细胞。

目前市场上用于CUTTag高通量文库制备的试剂盒有诺维赞公司。这些试剂盒能满足不同的样品来源，最大程度的满足了科研应用，但是，目前市场上还没有一种能够完成原始文库精准定量的文库制备方法及试剂盒。现有的CUTTag文库的制备方法仍然存在系统性误差。因此，需要建立一种精准定量的CUTTag文库制备方法及试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种精准定量的CUTTag文库制备方法及试剂盒，实现精准定量。

本申请的一方面，提供一种精准定量的CUTTag文库制备方法，所述方法包括：

(a)提供两种衔接子，第一衔接子为5`-S1-S2-S3-3`，第二衔接子为5`-S4-S5-S6-3`，所述S1为第一测序引物，S2为随机标签序列，S2的碱基为A、T、G、C中的一种或多种的随机组合，S2的碱基的数量为1-95的任一整数，所述S3与S6的碱基序列相同，为Tn5转座子固定序列，S4为第二测序引物，S5为随机标签序列，S5的碱基为A、T、G、C中的一种或多种的随机组合，S5的碱基的数量为1-100的任一整数；将所述两种衔接子与pA-Tn5酶进行孵育得到转座复合体；

(b)再将转座复合体与测试样本进行孵育，得到扩增模板；

(c)将所述扩增模板进行PCR扩增，得到测序文库。