[发明专利]一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗为通过构建一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，再经293TD37细胞包装而获得；

所述四种抗原基因分别为L8Lubiqutin、I215L、I73Rhbsag和E146L，其中L8Lubiqutin是在L8L上添加分子佐剂ubiqutin获得，I73Rhbsag是在173R上添加分子佐剂hbsag获得，L8Lubiqutin和I215L表达在E1区，I73Rhbsag和E146L表达在E4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-L8Lubiqutin-I215L-I73Rhbsag-E146L；

其中，所述重组腺病毒载体pAd5LCL3-L8Lubiqutin-I215L-I73Rhbsag-E146L需通过由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的293TD37细胞实现重组腺病毒包装，293TD37细胞的细胞株保藏编号为：CCTCC NO:C201996，保藏于中国典型培养物保藏中心；

其中，L8L、ubiqutin、I215L、I73R、hbsag、E146L、pAd5LCL3分别具有如序列表中Seq IDNO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO.6、Seq ID NO.7所示的核苷酸序列。

2.一种权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包含以下步骤：

1）利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒的E1基因，引入SwaⅠ酶切位点，融合后的片段与载体无缝克隆，再利用CRISPR/cas9敲除E3基因，再使用无缝克隆方式连接，获得缺失E1和E3基因的腺病毒载体质粒pAd5；

2）再利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5的E4基因，使用PCR扩增并引入I-sceI酶切位点，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5△E4；

3）利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5△E4的E2a基因，并将E4区的ORF6/7表达框放在敲除了E2a区的序列位置，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3、E4和E2a基因的腺病毒载体质粒pAd5LCL3；

4）构建腺病毒E1区域穿梭质粒pS5E1，通过DNA连接酶分别与L8Lubiqutin、IRES、I215L基因片段连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1-L8Lubiqutin-IRES-I215L；

5）构建腺病毒E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP，I73Rhbsag、2A、E146L基因通过融合PCR技术得到I73Rhbsag-2A-E146L基因片段，通过对穿梭质粒pS5E4-EGFP酶切，敲除EGFP，并通过DNA连接酶与I73Rhbsag-2A-E146L连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-I73Rhbsag-2A-E146L；

6）将穿梭质粒pS5E1-L8Lubiqutin-IRES-I215L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组，得到腺病毒载体质粒pAd5LCL3-L8Lubiqutin-IRES-I215L；

7）将穿梭质粒pS5E4-I73Rhbsag-2A-E146L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3-L8Lubiqutin-IRES-I215L同源重组，获得四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-L8Lubiqutin-I215L-I73Rhbsag-E146L，pAd5LCL3-L8Lubiqutin-I215L-I73Rhbsag-E146L具有如序列表中Seq ID NO.8所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的腺病毒环状载体质粒来源于在A549细胞中扩增野生型人腺病毒5型病毒，收集并浓缩病毒液，采用HirtVirual DNAExtract方法提取腺病毒5型基因组，使用cosmid方法将线性的腺病毒5型基因组构建成环状的腺病毒环状载体质粒。