[发明专利]一种获得人类基底板Floor Plate细胞的方法及其应用有效
| 申请号： | 202110764495.5 | 申请日： | 2021-07-06 |
| 公开（公告）号： | CN113493773B | 公开（公告）日： | 2023-06-09 |
| 发明（设计）人： | 陆建峰;芦心雨;曹立宁 | 申请（专利权）人： | 上海市东方医院（同济大学附属东方医院）;同济大学 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/12;C12N5/079 |
| 代理公司： | 上海智信专利代理有限公司 31002 | 代理人： | 吴林松;唐丽莎 |
| 地址： | 200120 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 获得 人类 基底 floor plate 细胞 方法 及其 应用 | ||
1.一种体外获得人类基底板细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括：
在体外培养的人胚胎干细胞的第19号染色体中插入NKX2.2基因的CDS区域和Tet-on可诱导表达系统,使人胚胎干细胞向神经前体细胞分化；
在人胚胎干细胞向神经前体细胞分化前期，诱导人胚胎干细胞低水平过表达转录因子NKX2.2；诱导人胚胎干细胞低水平过表达转录因子NKX2.2，即在培养基中添加DOX，添加DOX的终浓度为0.008-0.03μg/mL；
在分化第一阶段前5-7天，培养基中加入诱导插入基因表达的DOX；在分化第二阶段，培养基中不添加DOX；
使人胚胎干细胞定向分化为人类基底板细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在人胚胎干细胞的19号染色体插入NKX2.2基因的CDS区域和Tet-on可诱导表达系统，是指电转可诱导过表达载体AAVS1-TRE3G-NKX2.2进入人胚胎干细胞系中。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，促进人胚胎干细胞向神经前体细胞分化是指使用N2B27培养基培养10-14天。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞分化前期是N2B27培养基培养的前5-7天。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，诱导人胚胎干细胞低水平过表达转录因子NKX2.2，即在培养基中添加DOX，添加终浓度为0.01-0.028μg/mL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分化得到的人类基底板细胞为功能性能够分泌SHH蛋白的人类基底板细胞。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人胚胎干细胞为通过在其19号染色体插入NKX2.2基因的CDS区域和Tet-on可诱导表达系统的H9细胞系。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)单层贴壁培养未分化的人胚胎干细胞；
(2)电穿孔转染插入NKX2.2基因的CDS区域和Tet-on可诱导表达系统的质粒进入人胚胎干细胞得到基因编辑的人胚胎干细胞系；
(3)在分化第一阶段前5-7天培养基中加入诱导插入基因表达的DOX；
(4)在分化第二阶段培养基中不添加DOX；
整个分化过程的时间为10-14天。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分化过程每日更换一次培养基，分化后期随细胞量的增加每日增加使用的培养基量。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，人胚胎干细胞的培养基为E8培养基。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的质粒包括px459-AAVS1-gRNA和AAVS1-TRE3G-NKX2.2。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的质粒比例为px459-AAVS1-gRNA质粒：AAVS1-TRE3G-NKX2.2质粒＝1:(1.5-3)，摩尔百分比。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分化第一阶段使用的培养基为N2B27添加BMP信号通路拮抗剂获得的培养基。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述BMP信号通路拮抗剂为Noggin，添加终浓度为450-600ng/mL。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分化的第二阶段不超过7天，使用的培养基为N2B27添加生长因子获得的培养基。
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