[发明专利]一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法

说明书

本发明公开了一种使用ES打靶技术获得的嵌合体鼠生殖遗传的挽救方法，包括以下步骤：S1多轮电转的ES克隆注射囊胚，获得低嵌合率小鼠；所述ES克隆加上EGFP表达；S2对低嵌合率小鼠进行毛色比例分析和鼠尾基因鉴定；S3小鼠精子冷冻；S4精子基因型鉴定；S5阳性比例高的精子进行体外受精IVF实验；S6受精卵培养到2细胞后进行荧光观察；S7筛选绿色荧光胚胎移植；S8出生小鼠DNA鉴定；本发明解决了多步ES技术打靶的克隆所得到的首建鼠嵌合率低生殖遗传不确定的问题。

技术领域

本申请涉及基因修饰模型鼠的生殖遗传比率分析方法及保种应用，属于生物技术领域，特别涉及一种ES多次打靶获得的低嵌合率首建鼠生殖遗传的挽救方法。

背景技术

现有的基因修饰技术：传统的转基因(TG)技术和近几年火热的CRISPR/Cas9 技术都是通过原核显微注射的方式将外源DNA注入核区，但TG方式获得的小鼠基因组是随机整合了外源DNA，表达水平也不一致；CRISPR/Cas9技术是通过Cas9 核酸酶通过sgRNA靶向切割DNA双链，诱导外源DNA与切口上下游的同源序列发生同源重组，该方法获得的小鼠基因组是定点修饰了外源DNA，但是sgRNA靶序列只有～20bp，Cas9核酸酶容易发生脱靶切割。ES(全能干细胞)打靶是建立在 DNA同源重组与胚胎干细胞等技术基础上的分子生物学技术，目前是模式动物制备的黄金标准。ES打靶技术成功避开了转基因的随机整合和CRISPR/Cas9无法避免的脱靶效应。

近几年，人源化动物模型已经被证明在解码人类疾病奥秘中具有巨大的优势和广泛的应用前景。由于人类生理与动物生理的差异，好多在动物模型上得到的实验数据在人体上无法复现。例如，新冠病毒依赖于ACE2蛋白感染人类，但是它不能识别小鼠细胞的ACE2蛋白，所以小鼠不会感染新冠肺炎，因此需要将小鼠的ACE2基因人源化。要在小鼠体内全部模拟人的ACE2基因表达，最好的方式是将小鼠的ACE2基因组全部替换为人的ACE2基因组。这涉及到近50kb外源DNA 序列的定点插入，但常规的打靶技术无法一次性定点插入几百Kb的大片段，因此需要用到ES细胞多次打靶编辑的操作。

现有技术问题：

1.传统的TG技术和CRISPR/Cas9技术无法实现几百Kb～1Mb的基因定点修饰，受精卵脆弱，无法通过电转方式导入大片段DNA，只能显微注射，操作要求极高，受精卵数量也有限，且大片段DNA整合效率很低。如有些人源化方案中，使用人源基因组序列可能很大，需要多个BAC拼接才能囊括全，这种情况可以拆分外源DNA片段通过ES细胞多次打靶来实现。

2.但经过多次电转筛选的ES细胞全能性会受到影响，多次电击对ES细胞极大的损伤包括染色体数量及形态异常，染色体DNA断裂丢失等；如果电转次数大于5次，即便筛选核型正常的ES克隆用于注射囊胚腔，产生的嵌合体小鼠嵌合比例会很低，而且生殖遗传比例不确定。

3.现有的关于鉴定动物胚胎方法，都是通过取胚胎部分细胞确定有外源 DNA基因型后再移植到供体，且要保证胚胎损伤小，存活率高。常用的方法有三种：①经典的胚胎取细胞方法是显微切割法，但该方法破坏了胚胎透明带的完整性，可能造成取细胞后的胚胎碎裂。②通过将显微注射针刺入胚胎内，用负压吸取细胞，该方法由于使用负压操作，可能造成取细胞后的胚胎负压损伤。③采用“打洞压迫法”使用正压从动物胚胎中取出部分细胞，该方法对胚胎还是有损伤。以上三种方法对胚胎发育都有损伤，而且工作量和操作性要求极高，个人实验数据差异也难以避免；并且采取的细胞量极少，必须结合细胞培养和多轮PCR 富集检验的方法鉴定基因型，鉴定周期长，PCR假阳性或假阴性概率也高。

发明内容

本发明的目的是解决多步ES技术打靶的克隆所得到的首建鼠嵌合率低生殖遗传不确定的问题。