[发明专利]碱性嗜热无机焦磷酸酶及其在增强聚合酶链式反应和合成UDP-半乳糖反应中的应用

说明书

一种碱性嗜热无机焦磷酸酶(Inorganic pyrophosphatase,PPase,EC3.6.1.1)及其在增强聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)和合成UDP‑半乳糖反应中的应用，属于生物工程技术领域。本发明所述的碱性嗜热无机焦磷酸酶是从嗜热细菌Thermococcus onnurineus NA1中筛选得到，记为碱性嗜热PPase Ton1914，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。结果表明，碱性嗜热PPase Ton1914对于不同长度DNA片段的扩增效率都有明显促进作用，且对于基因长度小的DNA模板的扩增效果更明显。在UDP糖焦磷酸化酶TTE0732催化1‑P‑半乳糖和UTP反应生成UDP‑半乳糖中添加碱性嗜热PPase Ton1914，可以进一步提高反应转化率。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉一种碱性嗜热无机焦磷酸酶(Inorganicpyrophosphatase,PPase,EC3.6.1.1)及其在增强聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction,PCR)反应和合成UDP-半乳糖反应中的应用。

背景技术

产物抑制效应指末端或副产物可以降低催化关键步骤酶活性的现象，是目前导致天然酶反应产率降低的重要因素之一，对工业生产有不利影响。生命体中的DNA和RNA聚合反应、氨基酸活化、脂肪酸氧化以及辅酶、纤维素、淀粉的合成等多种生命活动都需要磷酸化反应维持平衡，而磷酸化反应不可避免地产生副产物焦磷酸根(PPi)，使得磷酸化反应效率被抑制。例如PCR，反应过程会产生大量PPi从而降低反应效率，因此，消除副产物PPi可以推动磷酸化反应的正向移动。

PCR是一种利用微量的DNA片段就可以扩增获得大量DNA片段的分子生物学技术。因其灵敏度高、特异性强、纯度要求低以及简便快速的特点，在生命研究、临床医学以及刑侦等方面发挥了至关重要的作用。PCR会产生大量副产物PPi，从而阻止PCR的正向进行，因此，提高PCR扩增效率的关键是消除PPi。由于PCR的反应条件是高温碱性环境，这使得酸性条件下清除PPi的化学法效果不佳。生物学上常采用PPase水解PPi，但PCR的高温反应环境会使酶的活性大幅降低甚至失活。因此，开发耐高温及耐碱性的新型酶或其它PCR增强剂成为热点。如专利CN104862288A利用聚合物-蛋白质偶联技术，在蛋白活性中心附近修饰一个N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，该聚合物具有温度响应性，可以增强蛋白质的热稳定性使常温蛋白适应高温PCR条件，同时水解PPi以达到增强PCR的效果，最终结果表明，该方法在60℃下的热稳定性比野生型提高88％，PCR效率也有明显提高。嗜热型PPase的开发近年来也小有成就，如专利CN106834249A通过突变提高嗜热PPase的表达效率和热稳定性。但关于嗜热型PPase对于PCR扩增效率提高的专利目前尚未见报道。也有商用的嗜热型PPase，例如从嗜热脂肪肝菌中提取出的PPase，但其价格昂贵，且购买渠道有限。因此，开发一种高效的热稳定性PPase迫在眉睫。本发明从还原硫超嗜热球菌属——Thermococcus onnurineus NA1中克隆纯化出一种嗜热型PPase，并将其应用于不同长度DNA模板的PCR中副产物PPi的去除，有效地提高了PCR扩增效率。目前，未见嗜热PPase用于提高PCR扩增效率的专利。

发明内容

本发明的目的是提供一种碱性嗜热无机焦磷酸酶(Inorganic pyrophosphatase,PPase,EC3.6.1.1)及其在增强聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)和合成UDP-半乳糖反应中的应用。本发明所述的碱性嗜热无机焦磷酸酶(Inorganicpyrophosphatase,PPase,EC3.6.1.1)是本实验室从嗜热细菌Thermococcus onnurineusNA1中筛选得到，记为碱性嗜热PPase Ton1914，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明所述的一种碱性嗜热PPase Ton1914，其是由如下步骤制备得到：