[发明专利]一种DNA甲基化位点分析方法、DNA生物传感器

权利要求书

1.一种甲基化DNA作为癌症早期诊断标志物在制备肿瘤治疗靶点药物中的用途，其特征在于，所述甲基化DNA核酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种癌症早期诊断试剂盒，其特征在于，所述癌症早期诊断试剂盒包含权利要求1所述用途中的核酸序列SEQ ID NO：3。

3.一种如权利要求1所述用途中甲基化DNA的DNA甲基化位点分析方法，其特征在于，所述DNA甲基化位点分析方法包括以下步骤：

步骤一，利用AuNPs@rGO复合材料修饰金电极；

步骤二，捕获探针、辅助探针以及不同甲基化位点的靶序列的设计；

步骤三，DNA杂交诱导金纳米粒子聚集信号放大；

步骤四，抗-5甲基胞嘧啶抗体特异性识别甲基化位点；

步骤五，电化学传感分析技术的最适实验条件的优化；

步骤六，电化学检测；

步骤七，血清中甲基化DNA的检测。

4.如权利要求3所述DNA甲基化位点分析方法，其特征在于，步骤一中，所述利用AuNPs@rGO复合材料修饰金电极，包括：

超声分散1h配置0.5mg/ml的GO溶液，在其中加入350μL 25％的氨和40μl肼，超声处理1h，于100℃磁力搅拌5h，得到还原氧化石墨烯rGO悬浮液；

将20μL 0.1M HAuCl₄溶液加入8mL rGO悬浮液中，超声处理15min后，在85℃下连续搅拌并快速注入新鲜制得的NaBH₄溶液和柠檬酸钠溶液，连续搅拌25min，离心去除多余成分后即得到AuNPs@rGO复合物；

将该复合物滴加到电极表面室温干燥备用；用透射电镜表征形成的AuNPs@rGO复合物，经超声分散后的氧化石墨为薄片状结构，且有明显的褶皱；AuNPs紧密均匀的分布在rGO片层上形成了AuNPs@rGO纳米复合材料。

5.如权利要求3所述DNA甲基化位点分析方法，其特征在于，步骤二中，所述捕获探针、辅助探针以及不同甲基化位点的靶序列的设计，包括：

分别设计捕获探针及其互补的辅助探针和不同甲基化位点数目的靶序列；在辅助探针的帮助下，捕获探针的发夹结构被打开并与靶序列形成三螺旋结构；

将捕获探针序列的5’端巯基化，与AuNPs@rGO复合物通过金-硫键被固定在电极表面；设计相同甲基化位点数目不同错配碱基个数的靶序列，用于传感器的特异性验证；

所述捕获探针的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，辅助探针的核酸序列如SEQ ID NO：2所示，靶序列的核酸序列如SEQ ID NO：3所示，杂交链A的核酸序列如SEQ ID NO：4所示，杂交链B的核酸序列如SEQ ID NO：5所示，杂交链C的核酸序列如SEQ ID NO：6所示，G链的核酸序列如SEQ ID NO：7所示，T1的核酸序列如SEQ ID NO：8所示，Tx的核酸序列如SEQ ID NO：9所示，Tn的核酸序列如SEQ ID NO：10所示。

6.如权利要求3所述DNA甲基化位点分析方法，其特征在于，步骤三中，所述DNA杂交诱导金纳米粒子聚集信号放大，包括：

将金纳米粒子分别用杂交链A、B、C修饰，杂交链A、B的5’端修饰有巯基，杂交链C的5’端用生物素标记；杂交链A、C修饰1号金纳米粒子，杂交链B、C修饰2号金纳米粒子，在A、B杂交链之间嵌入电活性物质亚甲基蓝；

两种金纳米粒子上都修饰有富G序列，在Na⁺或K⁺离子存在下形成G四联体，加入血红素则形成具有催化活性的DNA酶，催化H₂O₂放大亚甲基蓝产生的电流响应信号；

步骤四中，所述抗-5甲基胞嘧啶抗体特异性识别甲基化位点，包括：

抗-5甲基胞嘧啶可以特异性识别靶序列上的甲基化位点，将抗体用生物素修饰，通过链霉亲和素与金纳米粒子上修饰的杂交链C结合，在H₂O₂存在下G链形成的DNA酶可催化放大亚甲基蓝在抗体结合位置产生信号放大效应；其中，信号大小与抗体数目有关，而抗体数目又与甲基化位点数相关，进而达到检测甲基化位点的目的。