[发明专利]一种检测斑马鱼Acsl1a基因突变的方法

权利要求书

1.一种检测斑马鱼Acsl1a基因突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取斑马鱼基因组DNA；

(2)利用引物P1和引物P2对步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增；所述引物P1为：5’-accgtggatggcttaagggtt-3’，引物P2为：5’-gtgtcttgtggtttgctttgcca-3’；

(3)利用Hpy188I内切酶对步骤(2)的PCR扩增产物进行酶切；

(4)对步骤(3)的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析酶切条带。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测Acsl1a基因突变是检测Acsl1a第7外显子TCTGA基因序列是否缺失；步骤(4)所述酶切条带包含大小为471bp的条带，则存在Acsl1a基因突变。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述提取方法为酚-氯仿抽提法、高盐沉淀法、离心柱法、磁珠法；优选为酚-氯仿抽提法。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酚-氯仿抽提法包括如下步骤：将斑马鱼的尾鳍组织进行组织裂解和蛋白酶消化后，加入Tris平衡酚和氯仿混匀，离心，上清液加入异丙醇混匀后-20℃静置，离心弃液后风干。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增体系为：灭菌的去离子水26.5μL；Buffer 3.5μL，dNTP 3.0μL，引物P1和引物P2各0.5μL，DNA 1μL，rTaq 0.1μL。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增参数为：预变性94℃，5min，1循环；变性94℃，30s，退火61℃，30s，延伸72℃，60s，35循环；72℃，10min，1循环。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述酶切反应体系为：Hpy188I10μL，PCR产物1μL，CutSmart Buffer 5μL，加灭菌去离子水至50μL。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述酶切的参数为：35～40℃孵育4～6h，60～70℃灭活10～30min。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酶切参数为：37℃孵育5h，65℃灭活20min。

10.权利要求1～9任一项所述的方法鉴别斑马鱼Acsl1a基因突变体的应用。