[发明专利]一种复合发酵剂制备方法及其应用

权利要求书

1.一种复合发酵剂制备方法，包括步骤一，培养基建立；步骤二，乳酸菌分离鉴定；步骤三，优良菌株筛选；步骤四，菌剂制备；步骤五，复合发酵剂制备；其特征在于：

其中上述步骤一中，按照重量份数选取10份的蛋白胨、10份的牛肉膏、5份的酵母膏、20份的葡萄糖、2份的柠檬酸钠、2份的乙酸钠、0.58份的硫酸镁、0.25份的硫酸锰、2份的磷酸氢二钾、1份的吐温80和1份的蒸馏水，在pH值6.28～6.7的环境下，121℃湿热灭菌30min制成MRS培养基；然后在MRS琼脂培养基中加入1.5％的碳酸钙，制成CaCO₃-MRS琼脂培养基；

其中上述步骤二中，首先进行乳酸菌的分离培养，分别取1mL的酸菜汁，通过逐级稀释的方法分别稀释10^-1至10^-7浓度级，取10^-3、10^-4和10^-5稀释液各0.1mL，用无菌玻璃刮铲依次涂布接种于MRS琼脂平板上，每个稀释度涂3个平板，置37℃培养48h，当出现溶钙圈、圆形稍扁平或凸起、白色或黄色，初步鉴定为乳酸菌；然后进行菌株的鉴定，先进行形态观察鉴定，用接种针取适量纯化后的菌体涂布在MRS培养基上，37℃培养48h，观察菌落在培养基上的大小、颜色、形状、边缘状况，之后取菌落涂片进行革兰氏染色，油镜下观察，然后进行菌株生理生化鉴定，将筛选纯化所得菌株参考《伯杰细菌手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，设计生化试验，分别进行过化氢酶、淀粉水解、柠檬酸盐、明胶液化测定和糖发酵试验；

其中上述步骤三中，首先进行分离菌株的产酸能力比较，在超净工作台中，挑取斜面上的菌株转接至MRS液体培养基中，37℃条件下活化菌株12-24h，再按2％的接种量接种活化后菌液至MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24h；将菌液混匀，在600nm的波长下测菌液的吸光度值，同时用pH计测定发酵液pH值，比较各菌株产酸能力，挑选生长较快和产酸能力强的菌株进行下一步的实验；然后进行分离菌株亚硝酸盐降解率测定，将在MRS培养液中活化后的菌株，以2％接种量接种于含有150μg/mL亚硝酸钠的MRS培养液中，37℃培养24h，测定培养前后培养液中亚硝酸钠含量，计算培养液中亚硝酸盐降解率；然后筛选菌株的生长曲线，并筛选菌株的耐酸能力比较；

其中上述步骤四中，首先，进行菌剂的制备，将筛选得到的菌株在MRS液体培养基中活化3代，扩大培养后进行离心处理，并弃上清液收集菌体，然后以10％的脱脂乳粉、10％的海藻糖和1％的谷氨酸钠作为保护剂，且经预试验确定各保护剂浓度，将配置好的保护剂与菌泥混合，按照菌泥∶保护剂为1∶3(w/v)比例混匀，分装到平板中，在-20℃冰箱中预冻24h，后真空冷冻干燥；

其中上述步骤五中，将植物乳杆菌、短乳杆菌、类肠膜魏斯氏菌按照不同比例分13组以接种量0.5％的质量浓度比芥菜发酵，密封发酵周期为7d，对发酵成品进行pH值和总酸含量的测定及感官评价；结合pH值、总酸含量和感官评定分数对不同菌种配比发酵酸菜效果进行分析，确定复合发酵剂的复配比例。

2.根据权利要求1所述的一种复合发酵剂制备方法，其特征在于：所述步骤二中，在进行菌株生理生化鉴定后，进行16S rDNA基因序列扩增及测序，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书实验操作步骤进行提取菌株基因组DNA，正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，PCR反应采用50μL反应体系，PCR条件为，94℃预变3min，94℃变性1min，56℃复性30s，72℃延伸1min，30次循环，最后72℃延伸5min，测定后的16S rDNA序列登陆NCBI进行BLAST比对。