[发明专利]一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因及其应用

权利要求书

1.一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因，其特征在于：所述RgWRKY37基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示。

2.一种地黄RgWRKY37蛋白，其特征在于：所述RgWRKY37蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

4.一种重组表达转化体，其特征在于：所述重组表达转化体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的重组表达转化体，其特征在于：所述重组表达转化体的宿主菌株为发根农杆菌MSU440。

6.如权利要求1所述的地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因在提高地黄毛蕊花糖苷含量中的应用。

7.一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因提高地黄毛状根中毛蕊花糖苷含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）采用基因克隆的方法从地黄中克隆获得转录因子基因RgWRKY37，所述RgWRKY37基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）把RgWRKY37基因连接于表达调控序列，构建含RgWRKY37基因的植物过量表达载体；

（3）将RgWRKY37基因的植物过量表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化地黄的含有RgWRKY37基因的植物过量表达载体的发根农杆菌菌株；

（4）将所构建的发根农杆菌菌株遗传转化地黄叶片，获得经PCR检测为阳性的转基因毛状根株系；

（5）定量PCR检测地黄转基因毛状根中RgWRKY37基因及毛蕊花糖苷生物合成途径中相关的催化酶基因的相对表达量；

（6）高效液相色谱法测定地黄转RgWRKY37基因毛状根中毛蕊花糖苷的含量，筛选毛蕊花糖苷含量提高的毛状根株系。

8.如权利要求7所述的地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因提高地黄毛状根中毛蕊花糖苷含量的方法，其特征在于，所述步骤（4）中PCR检测方法如下：

a、设计发根位点基因rolB的特异PCR引物，进行PCR扩增；

b、在RgWRKY37基因内部和35S启动子内部设计特异性引物，进行PCR扩增；

C、紫外线下观察目的条带，出现扩增条带则为阳性转基因地黄毛状根系。

9.如权利要求7所述的地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因提高地黄毛状根中毛蕊花糖苷含量的方法，其特征在于，所述步骤（5）中定量PCR检测方法如下：

a.对PCR鉴定为阳性的毛状根进行总RNA的提取，RNA用量为1.0 μg，反转录体系为20 μL；

b.分别设计RgWRKY37、关键酶基因和内参基因RgTIP41的定量引物，以相同量的cDNA为模板进行定量PCR检测；

c.分析RgWRKY37及毛蕊花糖苷合成途径相关基因的相对表达量。

10.如权利要求7所述的地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因提高地黄毛状根中毛蕊花糖苷含量的方法，其特征在于，所述步骤（6）中毛蕊花糖苷的测定方法为HPLC法，具体测定方法如下：将毛蕊花糖苷粗提物各取20 μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱为Dikma Diamonsil C18反向硅胶柱，流动相为乙腈-0.1%醋酸水，乙晴与0.1%醋酸水的体积比为16:84，柱温30℃，流速1min/mL，检测波长为334 nm。