[发明专利]一种鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株及构建方法

说明书

本发明涉及一种稳定表达增强型绿色荧光蛋白的鼠伤寒沙门氏菌菌株及其构建方法，属于基因工程技术领域。该鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株分类命名为Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏号为CGMCC No.22723；保藏时间为2021年6月16日。该菌株以ATCC 14028沙门氏菌菌株为基础，通过导入PagC‑EGFP质粒以实现胞内沙门氏菌的荧光观察，解决了现有荧光沙门氏菌菌株难获得、荧光信号不强、感染能力弱、适应性不广的缺点，是研究沙门氏菌与细胞的互作机理研究的理想的生物材料。

技术领域

本发明涉及一种稳定表达增强型绿色荧光蛋白的鼠伤寒沙门氏菌菌株及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhinuurim）是导致肠道感染的重要人畜共患病原菌，是一种革兰氏阴性杆菌。鼠伤寒沙门氏菌主要通过污染的食物或水经粪口传播，经胃入肠后，在肠道内增殖，粘附于肠黏膜上皮细胞，侵入固有层，引起的症状轻至肠炎重至败血症。鼠伤寒沙门氏菌在宿主体内散播的分子机制尚待进一步确定。目前对鼠伤寒沙门氏菌的研究主要集中在对其致病因子表达调控网络，毒力因子特异抗体的制备，新型药物靶点的寻找等。这些研究需明确鼠伤寒沙门氏菌的生理、病理特点，以及其与宿主之间的互作。因此需要有效的途径实时观测细菌在宿主细胞内的行为状态。荧光蛋白标记系统作为一种分子标记技术可直观地观测到病原菌与宿主相互作用的过程，因而被广泛应用于细胞生物学。

目前荧光沙门氏菌菌株多基于pUCP18、pKK223系列质粒构建，如ATCC公司的Salmonella 14028 GFP菌株采用的是pUCP18MCSgfpmut3质粒转化沙门氏菌所得，优点是荧光信号较强，缺点是该菌株所含荧光质粒的结构尚未见报道，且国内难以获得。pPpagCGFP_OVA和pPtacCGFP_OVA 质粒是疫苗研发应用较为成功的沙门氏菌荧光质粒，主要针对SL3261减毒型沙门氏菌菌株设计(Dirk Bumann 2001; Meike Wendland, Dirk Bumann2002)，含上述两种质粒的SL3261等减毒型沙门氏菌菌株缺乏aroA、pAB、DHB等关键致病基因，感染细胞的能力比14028标准沙门氏菌菌株略弱，在沙门氏菌与细胞的互作机理研究方面没有明显优势。此外，用pPpagCGFP_OVA、pACYC和pSIF等质粒构建的荧光沙门氏菌因载体中的四环素抗性基因可影响吞噬胞内的沙门氏菌的存活和生长，也不能作为沙门氏菌与细胞的互作机理研究的理想的生物材料(Stephanie Abromaitis, et al. 2005)。针对以上各种质粒的结构和优缺点，有必要研发一种1）具有自主知识产权；2）荧光信号较强，适合胞内细胞生物学实验观察；3）感染细胞能力较强的荧光质粒，以满足人们研究使用的需要。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株，以解决现有荧光沙门氏菌菌株难获得、感染能力弱、荧光信号不强、适应性不广的缺点。

本发明的技术方案是：

一种鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株，其特征在于：所述的该鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株分类命名为Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏号为CGMCC No. 22723；保藏时间为2021年6月16日。

所述的鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株，采用基因工程法构建其具体构建步骤如下：

1、目的基因PagC启动子的扩增和纯化