[发明专利]一种枯草芽孢杆菌的培养方法及其应用

说明书

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌的培养方法及其应用，所述枯草芽孢杆菌为保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61565的菌株，本发明利用培养系统对枯草芽孢杆菌的培养条件进行更精准的控制，有效降低培养过程中泡沫的产生，以及有效对培养的温度以及培养的溶氧量进行有效控制，获得杂质更少、活性更高的培养发酵液；另外，枯草芽孢杆菌经过三级发酵后，其代谢产物对产气荚膜梭菌病具有显著的离体和活体防治作用，对产气荚膜梭菌的抑菌圈平均直径可达26.78mm，对产气荚膜梭菌引起的产气荚膜梭菌病的防治效果达98.71％。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种枯草芽孢杆菌的培养方法及其应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌是一种可产生抗逆内生孢子的杆状细菌，分布于自然界中的一种革兰氏阳性细菌，能用于生产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶，用于改善动物肠道菌群、提高消化酶活性，对人畜无害，不污染环境，可在酶制剂工业，畜牧业饲料行业广泛应用。枯草芽孢杆菌能够在生长的过程中产生有用的代谢产物，且大部分分泌在培养基质中。现有技术中培养枯草芽孢杆菌在培养的过程中由于原料中的淀粉吸水膨胀并水解造成培养基体系的黏度短时间内大幅增加，空气传递受到影响而引起界面液膜，过量的泡沫会影响枯草芽孢杆菌的生长，且形成的界面液膜破裂的难易程度与液膜的强度以及培养的条件有关。另外，在枯草芽孢杆菌对培养的温度以及溶氧量要求较高，在厌氧的条件下，其不能充分利用培养基进行繁殖，溶氧量过高，其大量繁殖，会伴有2,3-丁二醇、羟基丁酮和酸产生，且培养条件不稳定，菌体为了应对生存环境的变化，开始诱导产生大量的内源孢子，芽孢内的吡啶二羧酸钙含量大幅增加，培养基体系酶活因母细胞的蛋白质更新而降低，因此，需要一个更精准的培养系统对枯草芽孢杆菌的培养条件进行监控。

综上，在芽孢杆菌的培养以及应用的过程中，仍然存在亟待解决的上述问题。

发明内容

基于此，为了解决现有技术中枯草芽孢杆菌的培养过程中容易产生泡沫、培养条件稳定的问题，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌的培养方法及其应用，具体技术方案如下：

一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisB-1166，保藏时间为：2021年3月17日；保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏编号为GDMCC No.61565；保藏形式为：真空冷冻干燥管。

一种枯草芽孢杆菌的培养方法，包括以下步骤：

活化菌株；

制备种子液；

制备液体种子培养基，并在所述液体种子培养基中接种所述种子液，进行第一次发酵以及第一次泡沫处理后得到初级发酵液；

制备第一液体发酵培养基，并在所述第一液体发酵培养基中接种所述初级发酵液，进行第二次发酵以及第二次泡沫处理后得到二级发酵液；

制备第二液体发酵培养基，并在所述第二液体发酵培养基中接种所述二级发酵液，进行第三次发酵以及第三次泡沫处理后得到三级发酵液。

进一步地，所述活化菌株为：将枯草芽孢杆菌划线接种于LB固体培养基平板上，并在35℃-39℃活化培养18h-28h，制得活化菌株。

进一步地，所述制备种子液为：将活化菌株接种于LB液体培养基中，在35℃-39℃、180-250r/min的条件下振荡培养18h-22h，制得种子液。

进一步地，所述液体种子培养基的组分包括：玉米浸渍液10g/L-15g/L、豆饼粉1g/L-3g/L、麸皮2g/L-4g/L、柠檬酸钠0.1g/L-0.4g/L、氯化钙0.01g/L-0.02g/L、磷酸氢二钾0.01g/L-0.30g/L、吐温0.01g/L-0.03g/L。