[发明专利]一种多重取代扩增技术制备重复序列的封闭试剂的方法

说明书

本发明提供了一种多重取代扩增技术制备重复序列的封闭试剂的方法，该方法包括：采用多重取代扩增技术对基因组DNA进行扩增；对扩增产物进行纯化后，打断至200‑300bp长度的DNA片段，所得产物即为重复序列的封闭试剂。利用本发明的方法制备重复序列的封闭试剂，可以规避现有技术方法存在的胎盘DNA不容易获得以及HAP柱分离法繁琐且费时费力的缺点。

技术领域

本发明是关于一种多重取代扩增技术制备重复序列的封闭试剂的方法，属于捕获建库技术领域。

背景技术

杂交捕获是NGS中目标区域捕获的主要技术之一，杂交过程中通常会采用两种封闭试剂来分别封闭adaptor序列和人类基因组上的重复序列。因为adaptor序列和人类基因组上的重复序列可能会和部分目标文库序列碱基互补结合，捕获磁珠捕获探针结合的目标区域文库的同时，这部分文库也结合在非目标文库上面，后续洗脱时候也洗脱不掉，从而使得非目标文库结合过多，导致捕获效率降低。所以不管是adaptor序列的封闭试剂，还是人类基因组上的重复序列的封闭试剂，任意一种封闭试剂使用错误的话都会显著降低捕获效率。

目前主流的液相捕获产品都会用到两种封闭试剂：通用封闭序列和Cot-1 DNA；通用封闭序列的作用是封闭文库接头，减少接头杂交；Cot-1 DNA的作用是封闭人基因组上的重复序列，减少重复序列杂交。

人基因组DNA的COT部分主要由快速退火的重复序列组成。SINE(小散在重复序列，例如Alu序列)和LINE(大散在重复序列，例如L1序列)等散在重复序列(IRS)在整个基因组中广泛分布。在富含这些重复序列的条件下，通过剪切、变性和再退火，由人胎盘DNA制备人COT DNA。

现有技术“人cot-1DNA的制备”(革文新等，人cot-1DNA的制备[J]《肿瘤》，1998年5月，第18卷第3期(127))报道了采用羟基磷石灰柱层析法(HAP柱分离法)分离制备cot-1DNA的方法。该方法是将获得的基因组DNA用超声波打断到需要大小，根据HAP的吸附能力和分离柱所装的HAP的量计算出所需要用的打断的DNA的量，100℃变性10min，冰浴骤冷，按照公式cot＝1＝mol/L×Ts计算DNA复性时间t，于60℃cot-1DNA复性t秒，复性结束后，立即置于冰浴中10min，加入等体积的水溶液，将样品加入到HAP分离柱上，经过调整磷酸盐的浓度，依次洗脱游离核苷酸等杂质，单链核苷酸，最终洗脱cot-1DNA洗脱峰，并收集，用两倍体积的乙醇室温沉淀收集的cot-1DNA，8000r/min室温离心20min，用适当的水溶解所得到的盐和cot-1DNA所得到的共沉淀混合物，然后用Sephadex G-50脱盐，收集DNA峰，加入1/10体积3M的醋酸钠，和两倍体积的酒精8000r/min4℃离心20min，收集沉淀得到cot-1DNA。上述制备cot-1DNA的方法-HAP柱分离法虽然制备效果可以满足杂交的需求，但是制作方法繁琐，且耗时耗力。目前，Invitrogen公司的商品cot-1DNA是常见的商品化的cot-1DNA，但是价格也是较为昂贵的。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种制备重复序列封闭试剂的新方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种制备重复序列的封闭试剂的方法，该方法包括：

采用多重取代扩增技术(MDA)对基因组DNA进行扩增；

对扩增产物进行纯化后，打断至约200-300bp长度的DNA片段，所得产物即为重复序列的封闭试剂。