[发明专利]一种检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法

说明书

本发明涉及一种检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法，以及用于检测青枯菌混合菌群复合侵染的青枯菌基因RSp1073的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。该方法包括参考菌株和样本菌株的DNA提取，目标基因的PCR扩增，以及测序和序列比对、分析等具体步骤。该方法可用于检测或研究多个序列变种、多个菌株共存的复合侵染状况，为后续分析单个感病植株中不同菌株的复合侵染情况提供方法，为进一步解析青枯菌的自然发生规律提供一定基础。还可以用于烟草青枯菌混合菌群中各菌株的数量鉴定，判断感染植株中青枯菌优势菌。为植株防治青枯菌尤其是用微生物菌剂防治青枯菌有重要关键作用。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法，还涉及用于该方法的引物对。

背景技术

青枯菌(Ralstonia solanacearum)是世界十大植物病原细菌之一，因其寄主范围大、分布范围广且具有丰富的遗传多样性而被认为是一个多变的复合种。目前有三种分类方法被广泛运用于青枯菌的分类中，包括早期的生理小种(Race)和生化变种(Biovar)，以及近年随着分子生物学技术的广泛应用被提出的演化型分类框架。Fegan和Prior于2005年在第三届青枯病国际会议上共同提出演化型分类框架(Phylotype classificationshemes)，该分类框架将青枯菌划分为种(Species)、演化型(Phylotype)、序列变种(Sequevar)以及克隆(Clone)四种不同水平的分类单元。演化型分类框架反应了青枯菌的种内遗传多样性与地理起源的密切关系：演化型Ⅰ即来自亚洲的菌株；演化型Ⅱ(包括演化型IIA和演化型IIB)即美洲菌株；演化型Ⅲ即来自非洲及其周边岛国的菌株；演化型Ⅳ即来自亚洲其他国家如印度尼西亚、澳大利亚等的菌株，及与青枯菌相近的R.syzygii和香蕉血液病细菌(Banana blood disease bacterium，BDB)。演化型之下依据内切葡聚糖酶基因(egl)的部分序列、hrpB基因等的系统发育分析又进一步分为不同的序列变种。青枯菌种具有丰富的多样性，在同一田块中有可能存在多个序列变种或者克隆菌株的情况，或是存在多个菌株的复合侵染。青枯菌基因型多样，适应性强，寄主范围广，病原菌菌株致病性差异明显，从而影响植物抗病品种的选育、种植年限等，以环境友好的微生物菌剂防治植物青枯病也是近些年植物病害研究的热点之一，但其防效不稳定，而植物青枯病菌的多样性是影响微生物菌剂防病效果的重要因素之一。

目前关于青枯菌的鉴定方法很多，对种的鉴定可以采用16S序列分析鉴定以及青枯菌种特异性引物对(759和760)；青枯菌种以下的菌株鉴定包括通过菌株对乳糖、麦芽糖、纤维二糖和甘露醇、山梨醇、甜醇的利用能力来鉴定生化变种的方法，采用演化型特异性复合PCR鉴定演化型的方法，利用egl基因部分序列进行系统发育分析来鉴定序列变种的方法。但是这一系列的方法均是对单一克隆的菌株进行鉴定，无法对被多种青枯菌株感染的鉴定。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种青枯菌基因RSp1073的引物对，由该引物对扩增出来的产物条带单一，引物特异性好。还提供一种检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种青枯菌基因RSp1073的引物对，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示。

2.青枯菌基因RSp1073的引物对在检测青枯菌混合菌群复合侵染中的应用，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种检测青枯菌混合菌群复合侵染的方法，包括以下步骤：

(1)、提取作为参考菌株的青枯菌DNA，菌株数量为大于1的整数；

(2)、提取待检测菌株样本DNA；