[发明专利]一种等温核酸扩增反应试剂、等温核酸扩增方法及其应用

说明书

本发明公开了一种等温核酸扩增反应试剂、等温核酸扩增方法及其应用，本发明提供的等温核酸扩增反应试剂选择莎梵婷、TX‑100、吐温20等温和的表面活性剂，与DMSO、蔗糖、海藻糖、热启动Bst聚合酶和耐高温热启动逆转录酶配合，反应特异性高，能够裂解病原体，释放其基因组核酸，且提供一个高度耐抑制缓冲体系，可实现对血液样本，呼吸道样本等进行直接扩增，实现免提取扩增。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种等温核酸扩增反应试剂、等温核酸扩增方法及其应用。

背景技术

在分子检测领域，用于靶标检测的方法包括PCR-直接测序法、PCR-焦磷酸测序法、荧光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-电泳分析、原位杂交(ISH)，等温扩增等多种方法。

PCR-Sanger测序法的操作过程主要包括PCR扩增和PCR产物纯化、测序反应、测序和结果分析四个主要步骤；PCR-Sanger的主要不足是：灵敏度不高，对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；操作复杂，成本相对较高，速度慢、通量低；PCR-焦磷酸测序法检测灵敏度较高，通过特殊的试剂和仪器主要进行短片段的分析；不能对长片段进行分析。实时荧光PCR法灵敏度高，分型准确，但该方法通量不高，探针成本较高，需在特殊的实验室区域进行PCR-电泳分析该方法是指对待分析的目的基因片段进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析，根据PCR产物的大小对基因多态性位点进行基因分型；PCR-电泳分析需要反复打开反应管进行操作，易造成环境污染。原位杂交(ISH)是在细胞核原位对基因的异常进行检测，成本高，通量低，时间较长。

体外核酸扩增被广泛用在研究、医学、食品科学等领域，其中最为广泛被研究和使用的是聚合酶链式反应(PCR)。然而PCR反应依赖于提高和降低反应混合物的温度循环，需要配备专用的热循环仪器才能进行，并且扩增时间长，一般需要几个小时，难以在基层尤其是一些偏远地区或条件较差的实验室推广使用。

针对常规PCR反应的不足，以核酸等温扩增技术为基础的检测技术得到了迅猛的发展。多种机制的等温技术完成了从实验室到实际应用的过渡，正逐步在分子生物学、医学、法学等领域得到广泛运用。特别是在临床和现场快速诊断技术方面，核酸等温扩增技术显示了其突出的优越性。更为重要的是，核酸等温扩增技术由于不需要温度变化的时间且摆脱了对精良仪器设备的依赖，使得我们对病原体的检测诊断得以快速并高通量的实现。

但是体外扩增技术在实际应用当中容易遇到抑制现象。采样方法、样本类型、提取试剂等影响得到的DNA或RNA模板的质量，导致不同程度的扩增抑制，有待进一步改善。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐抑制性好、反应特异性高的新型等温核酸扩增反应试剂、等温核酸扩增方法及其应用。

为实现本发明的目的，本发明提供了一种等温核酸扩增反应试剂，其包括以下组分：

DMSO、蔗糖、海藻糖、TX-100、莎梵婷、吐温20、MgSO₄、热启动Bst DNA聚合酶、dUTPMix、尿嘧啶DNA糖苷酶及耐热型MMLV逆转录酶。

进一步地，所述反应试剂中，各组分的终浓度为：

进一步地，所述反应试剂还包括酸碱指示剂和/或荧光染料和/或荧光探针。

更进一步地，所述酸碱指示剂为酚红，或者所述荧光染料为SYTO9。

进一步地，所述反应试剂还包括引物组合物，所述引物组合物包括6条茎环信标结构引物IF1,IF2,IF3,IR1,IR2,IR3。

进一步地，所述引物组合物的摩尔比为：IF1:IF2:IF3:IR1:IR2:IR3＝1:1:1:1:1:1。