[发明专利]一种枯草芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用，该菌剂由枯草芽孢杆菌菌种活化、液体发酵培养、陶瓷膜过滤、喷雾干燥后获得，可用于防治各种农作物的真菌和细菌病菌侵染，该制备方法简单，具有发酵周期短、放罐活孢子数高、陶瓷膜过滤收率高和防治效果好、稳定性强的优点。

技术领域

本申请涉及微生物生物学技术领域，具体而言，涉及一种枯草芽孢杆菌菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

真菌、细菌性病害是危害农作物生长的两类大病害，一直严重危害着农业生产；目前，常用的防治真、细菌性病害的药剂主要是化学农药。化学药剂通常存在对有些病害防治效果一般，对生态环境及农产品质量安全影响很大。

现有枯草芽孢杆菌制剂多为单一作用功能，要么只能防治真菌性病害，要么只能防治细菌性病害，且现有菌剂活性衰减率≥60%，遗传变异率≥70%，抗环境干扰性弱工业化产出1500左右（亿芽孢/克），防治率≤60%。虽然现有技术中也有一些声称能够同时防治真菌和细菌病害的枯草芽孢杆菌菌剂，但是这些菌剂的制备均为高温及长周期发酵，菌株防效范围窄、防治率不高，且高温与长周期发酵工艺耗能不经济。例如CN102146352A（一种枯草芽孢杆菌及其应用）发酵周期过长，48~72小时，且耗能大；该菌剂也仅仅在杨木变色病中的应用。CN103146617A（一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用）采取高温35~38℃培养，长周期发酵48~72小时的耗能较大；仅对黄瓜、西瓜黄萎病（真菌性病害）有防治作用。CN104232514A（一种枯草芽孢杆菌及其应用）和CN104263673A（一种枯草芽孢杆菌B51及其应用）采取高温28~35℃，48~72小时的长周期发酵，应用剂型为发酵液（杂质多，此剂型极不稳定，难以形成规模化应用），仅对草莓根腐病、灰霉病及小麦赤霉病有一定的防效。CN111778173A（枯草芽孢杆菌Pro1A2、其菌剂和制备方法及在甜瓜栽培中的应用）采取28~35℃，二级发酵，第一级：12~16小时；第二级：36~48小时，应用剂型为发酵液（杂质多，此剂型极不稳定，难以形成规模化应用）。CN201810195833.6（枯草芽孢杆菌菌株及其应用）虽能防真细菌病害，但其发酵生产工艺依然传统，整个发酵周期长达40小时，造成防效率不高。目前，还没有一株在真、细菌混发引起的病害上取得成果的高效双防微生物菌剂产品。至今依然缺乏高效、广谱、低毒、低残留的以防治真、细菌性病害为主的微生物生物菌剂。

现有制备枯草芽孢杆菌的方法通常采用液体两级发酵，取得发酵液，经预处理后再使用板框或碟式离心机浓缩，然后进行喷雾干燥得到原粉；发酵液经过板框或碟式离心机分离，固液分离，分离速度快但是收率低。另外，采用多级发酵还会造成菌株变异（突变）快、早衰、杂菌率高等问题，使得制备的菌剂产品稳定性差，使用效果不稳定。

发明内容

本发明提供一种枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

（1）枯草芽孢杆菌菌种活化，得种子液；

（2）种子液加入液体发酵培养基中进行液体发酵培养，得发酵液；

（3）发酵液用陶瓷膜过滤，得浓缩液；

（4）浓缩液经喷雾干燥，得菌剂原粉。

具体的，步骤（1）中的菌种活化包括在固体培养基上进行二次传代培养（国内目前生产使用的均在第五代以上），确定生产用菌株，在固体培养基上扩繁。

步骤（2）中的液体发酵培养包括以30%的接种量（大种量）将种子液接种于液体发酵培养基中，在pH值6.8-8.5条件下培养30小时，低碳且经济。当pH值异常升高时，在确定未染菌的情况下，补充适量10%葡萄糖，同时降低空气流量，至到pH值恢复正常。

液体发酵培养基配方如下：淀粉2.46%；葡萄糖0.89%；冷榨黄豆饼粉（细度≥60目）2.15%；热榨花生饼粉（细度≥60目）2.15%；蛋白胨0.11%；鱼粉0.15%；硝酸钾0.11%；酵母粉0.16%；碳酸钙0.16%；硫酸铵0.16%；消泡剂0.05%，余量为水。