[发明专利]一种无膜转录调控器及其在精准调控基因表达中的应用

说明书

本发明涉及一种无膜转录调控器及其在精准调控基因表达中的应用。本发明基于内在无序序列或多价肽段相互作用形成低聚合物，结合蛋白与蛋白之间相互作用，构建可由小分子诱导或光诱导的转录因子聚集系统，称为无膜转录调控器，将该调控器应于基因表达调控，能够在不同小分子浓度或不同光诱导下，通过改变化学小分子的浓度或光强度诱导转录因子不同程度的聚集，改变转录因子的聚集状态，提高转录因子的激活能力，显著激活下游基因的表达，从而实现基因表达的高效精准调控。

技术领域

本发明涉及合成生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种无膜转录调控器及其在精准调控基因表达中的应用。

背景技术

非线性调控(超敏调控)具有过滤低的刺激信号(低于阈值)和灵敏响应S型曲线区间(阈值范围内)信号的调控特点，在信号处理和决策制定等生命进程中发挥重要作用。如Bicoid，它是果蝇胚胎发育中形态发生相关的转录因子，在早期果蝇胚胎的前后轴(Anterior-posterior axis，A-P轴)中呈梯度分布。在A-P轴上梯度分布的Bicoid以协同的方式结合在具有多重Bicoid结合位点的下游基因上，非线性的调控下游基因(Hunchback等)表达，从而调控胚胎发育的斑图的形成。在哺乳动物细胞中，研究人员也发现超级增强子为转录激活元件的结合提供丰富位点，并促进增强子相关蛋白协同性结合，从而提高对转录元件的响应敏感性和产生更高的转录输出。

鉴于非线性转录调控在基因网络中的重要作用，越来越多的研究希望开发出更多的非线性调控元件，用于基因网络的研究和工程化设计。这些研究的设计理念大多如以下形式。(1)基于变构效应的理性设计：变构调控是细胞中酶等蛋白质发挥功能的重要方式，当配体结合在目标分子上时，通过诱导目标分子变构而激活或抑制其活性，实现信号级联。转录因子的变构可以实现对不同的激活效应元件的招募能力和实现不同DNA结合能力，从而影响其激活性能。例如：乳糖抑制元件(lactose repressor，LacR)可以结合在下游基因位置并抑制下游基因表达。通过效应分子诱导的变构作用可以降低LacR与DNA的结合，从而失去转录抑制能力。通过突变其与效应器的结合口袋，可以改变LacR与效应器结合的热力学常数，进而改变其DNA结合能力和转录调控协同性。随着对蛋白结构认知的深入，通过热力学稳定性指导的转录因子变构调控的理性设计，可以获得更多的超敏转录调控元件。(2)基于融合多聚化模块的设计理念：转录因子的二聚化和低聚化通常会提高转录激活的协同性，基于此特性，研究人员通过给转录因子融合低聚蛋白结构域的方式，可以提高转录因子的协同调控能力。通过给转录因子(CymR)融合434噬菌体阻遏蛋白的多聚化结构域(CI434oligomer)，构建低聚化的转录因子。与正常转录因子相比，低聚化的转录因子具有更高的非线性调控能力。他们在不同的转录因子上(PhlF、LmrA、MazE、Cro和TrpR等)验证了这种基于融合多聚结构域提高转录调控协同性的设计方案，表明这种设计理念具有普适性。(3)基于多价组装的设计理念：真核基因通常被多价转录因子复合物调控，这些转录因子通过协同性组装，形成非线性的转录调控模式。基于这种现象，研究人员在酵母细胞中构建锌指蛋白和转录激活域的融合蛋白，并在融合蛋白上连接不同数量的多价PDZ结构域。他们发现融合多价结构域可以提高转录因子的协同性，且多价结构域的数量和多价相互作用强度参与决定协同转录激活的强度。基于多价组装的设计理念，研究人员可根据需求选择适宜的多价作用元件，实现多种基因回路的动力学调控。

基于上述非线性转录因子的设计理念，科学家们能够实现超敏的转录调控。然而，上述元器件在设计和构建完成后，其非线性激活能力固定(希尔系数和Kd值不再发生改变或不可被调控)，难以满足多种生物场景中的应用。基因元件是基因回路设计的灵魂，提高元件性能是优化基因网络设计的重要途径。尽管人们已经能在细胞内设计并构造一些复杂网络，然而生物学的的探索和应用永无止境，类似于生物芯片等设想的实现还需要更多更优良的基因元件。除优化当前元件设计和查找方案外，从新的设计角度丰富元件库亦是使合成生物学不断前行的动力来源。因此，可诱导和可调控的非线性元件设计具有迫切的科学需求和广泛的应用场景。