[发明专利]一种用于人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含链霉亲和素与供体结合物的组份SA-GG、含生物素与VASP-P抗体Ⅰ的结合物的组份Bio-Ab、含VASP-P抗体Ⅱ与受体结合物的组份FG-Ab、样本前处理缓冲液、含前列腺素E1的样本激活剂和含前列腺素E1和ADP的样本抑制剂，所述组份Bio-Ab含与生物素结合的VASP-P抗体Ⅰ，所述与生物素结合的VASP-P抗体Ⅰ为自制备鼠单抗，鼠单抗重链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2 所示，鼠单抗轻链可变区氨基酸序列如序列表SEQID NO.4所示，VASP-P抗体Ⅱ是在239丝氨酸位置磷酸化的VASP。

2.根据权利要求1所述的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所述组份SA-GG含有与链霉亲和素结合的能够在激发状态产生单线态氧的供体，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒，直径为180-220nm。

3.根据权利要求1所述的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所采用的免疫原为人工合成序列如序列表SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求1所述的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所述组份FG-Ab含与VASP-P抗体Ⅱ结合的与单线态氧反应生成可检测信号的受体，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒，直径为180-220nm。

5.根据权利要求1所述的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒，其特征在于，所述组份Bio-Ab中VASP-P抗体Ⅰ能够与血管扩张刺激磷蛋白的第一表位特异性结合，组份FG-Ab中VASP-P抗体Ⅱ能够与血管扩张刺激磷蛋白的第二表位特异性结合，且所述第二表位和所述第一表位不相重叠。

6.一种采用权利要求1~5任一项所述的人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

a）样本前处理：取样本激活剂干粉和样本抑制剂干粉分别用样本前处理剂溶解后，分别取10μl加入等体积的全血待测样本或校准品，混匀，室温孵育10min；

b）孵育后加入等体积的组份FG-Ab和组份Bio-Ab，孵育，进行第一步反应；再加入组份SA-GG进行第二步反应；

c）激光照射反应孔，测量每个反应孔的光信号值。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述组份SA-GG采用如下步骤制备：感光颗粒和链霉亲和素10:1的比例加入0.1M 2-（N-吗啉）乙磺酸MES缓冲液，37℃反应避光震荡48小时。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述组份Bio-Ab采用如下步骤制备：将VASP-P抗体Ⅰ加入碳酸钠缓冲液中，加入活化生物素，37℃反应12-18小时后，进行透析，透析结束后加入Tris-Hcl缓冲液进行悬浮和保存。

9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述组份FG-Ab采用如下步骤制备：将受体加入碳酸钠缓冲液中，加入VASP-P抗体Ⅱ，迅速斡旋混匀，37℃避光反应，加入含75mg/ml Gly的碳酸盐缓冲液，去液体，得到VASP-P抗体Ⅱ和受体的结合物，加入Tris缓冲液进行重悬即为组份FG-Ab。

10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述含前列腺素E1的样本激活剂和所述含前列腺素E1+ADP的样本抑制剂使用时采用样本前处理缓冲液稀释至2-20μmol/L。