[发明专利]鸟氨酸环化脱氨酶催化合成L-哌啶酸的方法

说明书

本发明提供了一种利用鸟氨酸环化脱氨酶制备L‑哌啶酸的方法，包括如下步骤：以L‑赖氨酸为底物，使用鸟氨酸环化脱氨酶SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5催化环化脱氨反应，得到L‑哌啶酸。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种利用鸟氨酸环化脱氨酶催化制备L-哌啶酸的方法。

背景技术

L-哌啶酸(CAS3105-95-1，L-pipecolic acid，简称PA)是亚氨基酸的一种，在大多数植物中以游离态存在，特别是在豆科植物中发现有较高的浓度，作为一种重要的刚性环状非蛋白质氨基酸，既可以限定多肽的构象，还可作为不同化合物合成库中的多功能骨架，可以广泛用于许多手性药物的合成，哌啶酸及其衍生物是一类应用广泛的医药中间体。例如，新一代局麻药罗哌卡因(Ropivacaine)、抗精神病药物硫利哒嗪(Thioridazine)、免疫抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)以及抗肿瘤抗生素山卓霉素(Sandramycin)等均是以哌啶酸或其衍生物为主要原料制得的。

由于哌啶酸及其衍生物具有的生物活性和广泛的应用前景，围绕其制备，人们已开发出许多合成的新方法和新技术。目前的制备方法主要分为生物化学催化、化学不对称合成和光催化合成。由于L-哌啶酸是手性分子，不对称手性合成较困难，因此利用选择性高的酶催化方法制备高光学纯度的L-哌啶酸一直是研究热点。

专利文献CN1529756A报道了根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens C58)来源的鸟氨酸环化脱氨酶(ornithine cyclodeaminase，OCD)、始旋链霉菌(Streptomycespristinaespiralis ATCC25486)来源的亚氨基肽酶pipA、吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)来源的赖氨酸环化脱氨酶(rapL)等酶将L-赖氨酸直接脱氨环化转化为L-哌啶酸。专利文献CN109402099A进一步报道了始旋链霉菌(Streptomycespristinaespiralis ATCC25486)来源的赖氨酸环化脱氨酶(Lysine cyclodeaminase，LCD)及其突变体可将L-赖氨酸转化为L-哌啶酸，证明酶催化方法将L-赖氨酸转化为L-哌啶酸这一路径是个有应用前途的绿色工艺。

然而，经实验证实，采用上述专利文献中报道的酶进行L-赖氨酸转化时的实际催化反应效率却相差甚远，明显偏低，远达不到工业化应用的酶活力/催化效率要求。

发明内容

为了探索酶催化L-赖氨酸转化法制备L-哌啶酸的工业化可行性，发明人对于众多微生物来源的鸟氨酸环化脱氨酶(OCD)、赖氨酸环化脱氨酶(LCD)、亚氨基肽酶pipA等酶进行了广泛筛选，终于筛选到几种酶活力比上述现有技术酶有明显提高(高出至少一倍)的酶品种，包括生黑孢链霉菌(Streptomyces melanosporofaciens)来源的鸟氨酸环化脱氨酶(NCBI登录号WP_093467660.1，氨基酸序列为SEQ ID NO:1)；以此酶为基础，我们还对其进行了突变，以便提高其酶活力。具体而言，本发明包括如下技术方案。

一种酶催化制备L-哌啶酸的方法，包括如下步骤：以L-赖氨酸为底物，使用鸟氨酸环化脱氨酶SEQ ID NO:1、或者其(G69V,G145L)突变体SEQ ID NO:3或(G69N,V142H)突变体SEQ ID NO:5催化环化脱氨反应，得到L-哌啶酸。

其中，鸟氨酸环化脱氨酶突变体SEQ ID NO:3其为野生型鸟氨酸环化脱氨酶SEQID NO:1氨基酸序列G69V、G145L的突变体：