[发明专利]溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株及其应用

说明书

本发明公开了溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株及其应用，属于基因工程技术领域。本发明公开的溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株在降低溶藻弧菌毒力中的应用。本发明利用CRISPR/Cas系统的高效性和准确性，构建溶藻弧菌的突变株，通过比较突变株与野生株对栉孔扇贝的致病性的强弱，证明了Hfq对溶藻弧菌毒性的重要作用，进一步研究了溶藻弧菌的致病机制。这些发现为进一步研究弧菌病奠定了基础。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株及其应用。

背景技术

水产养殖业在全球范围内发展迅猛，而贝类养殖已经成为了水产养殖业的支柱产业，随着养殖规模的增加，弧菌病频发，导致大量贝类死亡，给养殖业造成了巨大的经济损失。溶藻弧菌是一种革兰氏阴性的人畜共患的条件性病原菌，它是海水养殖中最常见和危害最严重的细菌性病原之一，能引起鱼类及贝类细菌性败血症和腮溃烂，给人类的健康也带来了严重的威胁。溶藻弧菌常常作为鱼类的致病菌被发现，在贝类中，以九孔鲍、菲律宾蛤仔患病居多。

细菌体内具有群体感应系统(QS)，能够对环境信号变化及时做出反应。该系统中调节小核糖核酸(SRNAs)在基因表达的转录后调节和毒性中起着重要的作用，而该过程需要RNA伴侣蛋白Hfq的参与。但目前关于Hfq在溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)对扇贝的毒力调控中的研究不多，基于此，深入研究溶藻弧菌的分子致病机理，对扇贝的溶藻弧菌病害暴发的防控非常重要。

因此，提供溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株，其保藏编号为CCTCC NO：M 2021539，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为2021年05月17日，分类命名为vibrio alginolyticus HD-1(Hfq缺失)。

进一步，靶向Hfq基因的pTargetF-Hfq重组质粒构建方法如下：

以pTargetF质粒为模板，用引物G2 F/G2 R构建含有20bp Hfq基因片段的pTargetF-Hfq载体；由于正反向引物具有反向互补位置，因此PCR产物为成环的结构，直接获得pTargetF-Hfq载体，经过胶回收过程，回收pTargetF-Hfq质粒；利用G1F/G1R进行16SrRNA测序；

其中，

G1 F/G1 R引物序列如下：

G1 F：5’-CCCCTGATTCTGTGGATA-3’；SEQ ID NO.4；

G1 R：5’-TTCAAGTTGATAACGGACTA-3’；SEQ ID NO.5；

引物G2 F/G2 R序列如下：

G2 F：5’-GCTACGTCGTGAGCGTATCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’；SEQ ID NO.2；

G2 R：5’-GGATACGCTCACGACGTAGCCTAGTATTATACCTAGGACTG-3’；SEQ ID NO.3；

反应体系为：Taq酶25μL，ddH₂O 19μL，稀释1000倍的pTargetF质粒2μL，G2 F/G2 R引物各2μL；