[发明专利]亮氨酸脱氢酶偶联光电催化制备辅因子的方法

权利要求书

1.一种亮氨酸脱氢酶偶联光电催化制备辅因子的方法，其特征在于，采用三电极体系，其中具有光阳极/阴极，体系中含有亮氨酸脱氢酶，浓度为10-15μg/mL；在光电催化条件下将NAD⁺或NADP⁺还原为NADH或NADPH；其中，所述的光电催化条件为：

1)光谱范围320～780nm；

2)线性伏安扫描曲线的扫描速率为15-25mV/s，范围为0.4～1.0V。

2.根据权利要求1所述的一种亮氨酸脱氢酶偶联光电催化制备辅因子的方法，其特征在于，光源功率200-500W，光谱范围320～780nm，光照距离15-25cm。

3.根据权利要求1所述的一种亮氨酸脱氢酶偶联光电催化制备辅因子的方法，其特征在于，线性伏安扫描曲线的扫描速率为20mV/s。

4.根据权利要求1所述的一种亮氨酸脱氢酶偶联光电催化制备辅因子的方法，其特征在于，体系的pH范围为9.5-10.5。

5.根据权利要求1所述的一种亮氨酸脱氢酶偶联光电催化制备辅因子的方法，其特征在于，所述的三电极体系，工作电极为BiVO₄/FTO，对电极为Pt丝，参比电极为Ag/AgCl；使用ddH₂O为电解液。

6.根据权利要求1至5任一项所述的一种亮氨酸脱氢酶偶联光电催化制备辅因子的方法，其特征在于，亮氨酸脱氢酶是通过包括如下步骤的方法制备得到：

(1)重组亮氨酸脱氢酶的诱导表达：将构建好的含有亮氨酸脱氢酶的工程菌进行活化，经发酵培养和诱导后表达出亮氨酸脱氢酶蛋白；

(2)亮氨酸脱氢酶的纯化：对诱导表达出蛋白的菌体进行收集，经超声破碎之后纯化，用SDS-PAGE电泳进行检测；

(3)测定蛋白浓度和酶活力。

7.根据权利要求6所述的一种亮氨酸脱氢酶偶联光电催化制备辅因子的方法，其特征在于，步骤(1)中，向10mL LB液体培养基中加入10μL卡那霉素，摇匀后接入100μL保藏的含有亮氨酸脱氢酶的工程菌，200rpm，37℃摇床中培养12h；向100mL LB液体培养基中加入100μL卡那霉素，摇匀后接入1000μL活化的菌种，200rpm，18℃摇床中培养3-4h；当OD₆₀₀达到0.5-0.6时，加入100μL的IPTG，继续培养20h。

8.根据权利要求6所述的一种亮氨酸脱氢酶偶联光电催化制备辅因子的方法，其特征在于：步骤(2)中，将诱导培养的菌液分装，4℃，8000rpm离心5min，弃上清液，用PBS缓冲液洗涤、然后在4℃、8000rpm、5min条件下离心，重复两次；弃上清液，用PBS缓冲液悬浮菌体。

9.根据权利要求6所述的一种亮氨酸脱氢酶偶联光电催化制备辅因子的方法，其特征在于：步骤(2)中，设置超声破碎程序为超声开时间8s，超声关时间6s，总时间7min，循环30次；将破碎液分装到EP管中，4℃，13000rpm离心20min；离心结束，取上清液，上清液即为粗酶液。

10.根据权利要求6所述的一种亮氨酸脱氢酶偶联光电催化制备辅因子的方法，其特征在于：步骤(3)中，使用酶标仪对样品进行340nm处吸光度变化的测定。