[发明专利]产大麻二酚的重组酿酒酵母、其构建方法以及应用

说明书

本发明公开了产大麻二酚的重组酿酒酵母，该重组酿酒酵母表达大麻二酚合成途径中的AAE1、CsPT4、OAC、OLS、CBDAS基因，且过表达tHMGR、AAE1和CBDAS基因;本发明还公开了该重组酿酒酵母的构建方法，是通过将AAE1、OLS、OAC、CBDAS、CsPT4基因整合到酵母菌染色体中，同时将tHMGR、AAE1和CBDAS的多拷贝添加诱导型启动子整合到酵母菌染色体中构建而成；本发明也公开了上述重量级酿酒酵母通过发酵生产大麻二酚的一种应用。本发明通过优化酵母菌株实现生物合成大麻二酚的目的，缓解当前市场上面临的大麻二酚缺口较大的问题，可广泛应用于大麻二酚的生产过程。

技术领域

本发明属于生物工程的技术领域，涉及酿酒酵母，具体地说，是一种产大麻二酚的重组酿酒酵母、其构建方法以及应用。

背景技术

工业大麻及大麻二酚的生产和应用在全球逐步合法化，药理效果显著，市场前景巨大；全球大麻二酚产业价值在2019年将达到57亿美元，到2021年将达到181亿美元。

工业大麻(Cannabis sativa)为一年生草本植物，大麻素是工业大麻中特有的功效物质，大麻素达70多种，其中四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)为其主要成分。THC是工业大麻是重要的活性成分，具有神经保护作用，但是因其具有致幻作用，被很多国家禁用；CBD是工业大麻中非致幻成分，在精神镇定、抗癫痫、抗炎及抗抑郁方面展示了巨大的药用潜质。除了活性成分，工业大麻的种子可作为一款中药火麻仁，其纤维广泛用于纺织工业。2018年6月份，美国FDA宣布批准了制药公司GW的Epidiolex口服液上市，在此之前2016年美国FDA授予该公司的Epidiolex(大麻二酚，CBD)治疗罕见遗传性结节性硬化症(TSC)的孤儿药地位。目前美国公司作为主要投资的AXIM(R)Biotech 使用含大麻二酚口香糖治疗肠易激综合征进入临床试验。此外，文献调研CBD 还可以缓解各种不同的疾病，包括肌肉痉挛、焦虑、恶心、慢性疼痛、炎症、失眠等，在精神分裂等方面也有一定的效果，但未见临床试验报道。

CBD原料分为两个级别，原料药及食品或化妆品级别，其中原料药CBD的纯度需要在99％以上，食品和化妆品级别在5-95％不等，CBD原料药主要在欧洲和美国生产，国内有少量的供应。CBD原料主要销往美国，而欧洲暂不允许进口CBD原料。我国国内CBD产能远远低于美国和欧洲市场，产能最大的汉素称其可以年产2吨，其他公司几乎很少；而康恩贝、紫鑫药业、龙津药业、顺灏股份、仁和药业、方盛制药等企业纷纷宣布投资进入工业大麻市场，在云南和黑龙江两个省份进行工业大麻的种植、提取及产品深加工的业务。相比美国和欧洲，国内工业大麻产业整体处理起步阶段，主要问题是无品种、提取分离技术落后、产能低、无深加工产品以及政策限制等系列问题。

在CBD原料制备上，化学合成也是一种思路，综合目前文献调研结果，其化学合成方法存在着步骤冗长、反应条件苛刻、原料无法大量获取、反应规模小等诸多问题。真正依靠化学合成实现大麻二酚原料药的产业化比较困难。

除了化学合成，在2019年加州大学伯克利实验室Keasling教授率先开展了酵母菌发酵合成大麻素类成分的研究。专利号为CN201880046655.9的中国发明专利，涉及“在酵母中生产大麻素”，提供了一种遗传修饰的酵母，其不仅利用了大麻素的产生基因和合成途径基因，还需要加入其他辅助性基因片段以及其他辅料；专利号为CN201880042884.3的中国发明专利，涉及“产生大麻素和大麻素衍生物的微生物和方法”，公开了一种产生大麻素及其衍生物的基因修饰的宿主细胞以及具体多肽序列，该申请是利用多肽和编码所述多肽的核酸序列修饰宿主细胞，但是对于具体的构建方法和生产大麻素及其衍生物的过程并未详细地披露。

发明内容

本发明的目的，旨在提供一种产大麻二酚的重组酿酒酵母菌株，通过优化酵母菌株实现生物合成大麻二酚的目的；

本发明的另一个目的，旨在提供上述产大麻二酚的重组酿酒酵母菌株的一种构建方法，以达到对该菌株简便、快速、有效、精准构建的目标；