[发明专利]一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种用来制备肝素七糖的二糖受体，结构式如式I所示：

2.一种用来制备肝素七糖的二糖受体的甲苷衍生物，结构式如式Ⅱ或式Ⅲ所示：

3.权利要求1所述的用来制备肝素七糖的二糖受体的制备方法，采用肝素酶III辅助化学酶法，包括步骤如下：

(1)以对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP)为起始原料、尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA)为糖基供体，在N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)酶促催化下进行糖链延长，得到二糖骨架，然后以得到的二糖骨架为受体、UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)为糖基供体，在Heparosan合酶2(PmHS2)酶促催化下进一步延长糖链，得到三糖骨架；

(2)将三糖骨架溶于氢氧化锂水溶液，于冰上静置至完全脱除GlcNTFA残基的三氟乙酰基，所得产物于弱碱性、室温下与对硝基氯甲酸苄酯(PNZ-Cl)混合反应，使N-未取代的葡糖胺(GlcNH₃⁺)残基的氨基保护，得到含N-对硝基苄氧羰基(PNZ)葡糖胺(GlcNPNZ)的三糖中间体；

(3)步骤(2)含GlcNPNZ的三糖于缓冲液中与肝素酶Ⅲ共同孵育，使GlcNPNZ与GlcA之间的糖苷键断裂，得到二糖受体。

4.权利要求1所述的用来制备肝素七糖的二糖受体的甲苷衍生物的制备方法，

将权利要求3制备得到的二糖受体与乙酰氯、甲醇混合并加热回流，经NaOH处理后，纯化得到二糖受体的α-或β-型甲苷衍生物。

5.根据权利要求3或权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述酶KfiA、PmHS2以大肠杆菌重组表达，N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)来源于大肠杆菌(E.coli)K5，Heparosan合酶2(PmHS2)来源于多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)；

步骤(1)中，酶促催化在缓冲液中进行，所用缓冲液为50mmol/L含5-8mmol/L MnCl₂的Tris-HCl，pH＝7.0～7.5，反应温度为20℃～37℃，反应液均以C18柱层析纯化；

步骤(1)中，起始原料用量为400-600mg的对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP)，糖基供体用量为1.2倍当量的尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA)，1.2倍当量的UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)；

步骤(2)中，所述LiOH溶液的浓度0.5mol/L，优选的，LiOH溶液的浓度为0.05mol/L～0.2mol/L；

步骤(2)中，对硝基氯甲酸苄酯(PNZ-Cl)的加入量为三糖的1.5倍量以上；

步骤(2)中，弱碱性pH为9-10；

步骤(3)中，肝素酶Ⅲ切割反应缓冲液为含8-12mM CaCl₂的Tris-HCl缓冲液，pH＝7.0～7.5，浓度为50mmol/L，反应温度20℃～37℃。

6.一种高选择性Xa因子抑制剂肝素七糖，含AT结合序列，具有如下如式Ⅴ结构式：

其中，R₁为氢(-H)、甲基(-CH₃)或其他烷基；R₂为氢、乙酰基(-COCH₃)或磺酰基(-SO₃H)；R₃为磺酰基或乙酰基。