[发明专利]一株适用多种感受态制备方法的高效价大肠杆菌克隆菌株及其应用

权利要求书

1.一株适用多种感受态制备方法的高效价大肠杆菌克隆菌株，其特征在于：所述菌株命名为BW3KD，是以大肠杆菌野生株BW25113为出发菌株，通过敲除其基因型中的基因endA、FhuA和DeoR制得。

2.权利要求1所述适用多种感受态制备方法的高效价大肠杆菌克隆菌株的构建方法，步骤是：

1)向出发菌株BW25113中转入pTKred质粒得到BW25113-pTKred菌株，以BW25113基因组为模板，设计带有50bp同源臂的引物endA-del-fr和endA-del-rev，以质粒pKD4为模板，PCR获得包含endA基因上下游50bp同源序列、FRT位点和Kan抗性基因的重组片段F-endA，序列顺序为“-上游同源臂50bp-FRT位点-卡那抗性基因-FRT位点-下游同源臂50bp-”，通过电转化将DNA片段endA-del转入BW25113-pTKred中，利用pTKred质粒表达的重组酶，在Kan的筛选压力下发生同源重组获得转化子，通过引物endA-fr-out和endA-rev-out进行菌落PCR验证，得到基因组endA处Kan替换的菌株，后转入pCP20质粒，利用pCP20质粒表达的flp酶使Kan抗性基因两侧的FRT位点发生同源重组去掉Kan抗性，通过在Kan和无抗平板上划线，获得去除Kan抗性的endA敲除株，命名为BW1K；其中，所述引物的核苷酸序列是：

endA-del-fr：cagctttcgctacgttgctggctcgttttaacacggagtaagtgatgtacCAGCATTACACGTCTTGAGCGAT

endA-del-rev：ggggttaacaaaaagaatcccgctagtgtaggttagctctttcgcgcctgGGAACACTTAACGGCTGACATG

endA-fr-out：GTGGTACCGCACGAACTGGCA

endA-rev-out：GCGACATCACCTGACCGAGG

2)向突变株BW1K中转入pTKred质粒得到BW1K-pTKred菌株，以BW1K基因组为模板，设计带有50bp同源臂的引物fhuA-del-fr和fhuA-del-rev，以质粒pKD4为模板，PCR获得包含fhuA基因上下游50bp同源序列、FRT位点和Kan抗性基因的重组片段F-fhuA，序列顺序为“-上游同源臂50bp-FRT位点-Kan抗性基因-FRT位点-下游同源臂50bp-”，通过电转化将DNA片段fhuA-del转入BW1K-pTKred中，利用pTKred质粒表达的重组酶，在Kan的筛选压力下发生同源重组获得转化子，通过引物fhuA-fr-out和fhuA-rev-out进行菌落PCR验证，得到基因组fhuA处Kan替换的菌株，后转入pCP20质粒，利用pCP20质粒表达的flp酶使Kan抗性基因两侧的FRT位点发生同源重组去掉Kan抗性，通过在Kan和无抗平板上划线，获得去除Kan抗性的fhuA敲除株，命名为BW2K；

其中，所述引物的核苷酸序列是：

fhuA-del-fr：

ATTCTCGTTTACGTTATCATTCACTTTACATCAGAGATATACCAatgGCGCAGCATTACACGTCTTGAGCGAT

fhuA-del-rev：

TGGGCACGGAAATCCGTGCCCCAAAAGAGAAAttaGAAACGGAAGGTTGCGGAACACTTAACGGCTGACATG

fhuA-fr-out：TGTGCCAGCAGAGCGAGATG

fhuA-rev-out：ACCAGTTCACGCACGGTCA

3)向突变株BW2K中转入pTKred质粒得到BW2K-pTKred菌株，以BW2K基因组为模板，设计带有50bp同源臂的引物deoR-del-fr和deoR-del-rev，以质粒pKD4为模板，PCR获得包含deoR基因上下游50bp同源序列、FRT位点和Kan抗性基因的重组片段F-deoR，序列顺序为“-上游同源臂50bp-FRT位点-Kan抗性基因-FRT位点-下游同源臂50bp-”，通过电转化将DNA片段deoR-del转入BW2K-pTKred中，利用pTKred质粒表达的重组酶，在Kan的筛选压力下发生同源重组获得转化子，通过引物deoR-fr-out和deoR-rev-out进行菌落PCR验证，得到基因组deoR处Kan替换的菌株，后转入pCP20质粒，利用pCP20质粒表达的flp酶使Kan抗性基因两侧的FRT位点发生同源重组去掉Kan抗性，通过在Kan和无抗平板上划线，获得去除Kan抗性的fhuA敲除株，命名为BW3KD，即为适用多种感受态制备方法的高效价大肠杆菌克隆菌株；

其中，所述引物的核苷酸序列是：

deoR-del-fr：

AGTGTAGTATTGAGCGGCTCGCTTCAATAACTATTCAGAGGGATTATGGAACAGCATTACACGTCTTGAGCGAT

deoR-del-rev：

GATGGCGCGAAACGTCATCCGGTTATACGTCATTAATACATCAACTTAATGGAACACTTAACGGCTGACATG

deoR-fr-out：GCGATCACGGTACGGTGAT

deoR-rev-out：CTCAGTGACCATACCGCGT。