[发明专利]用于人RASSF1A基因甲基化检测的特异性引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明属于DNA甲基化检测领域，特别涉及一种用于人RASSF1A基因甲基化检测的特异性引物、试剂盒及方法。克服现有特定CpG位点的甲基化检测方法操作繁琐，检测仪器成本高的技术问题。引物组包括甲基化特异性引物对和未甲基化特异性引物对，对RASSF1A基因启动子区域特定CpG位点进行识别与扩增；在甲基化特异性引物对和未甲基化特异性引物对中正向引物的5'端均标记地高辛，反向引物的5'端均标记生物素。通过优化引物在保证准确性、操作简便性的同时提高了速度和灵敏度，0.1％的靶点变异可在90分钟内区分，较之前DNA甲基化试纸条检测方法显著提高了速度和灵敏度。且检测过程中仅通过试纸条目视化判读结果，极大地降低了整个检测的成本。

技术领域

本发明属于DNA甲基化检测领域，特别涉及一种用于人RASSF1A基因甲基化检测的特异性引物组、试剂盒及方法。

背景技术

近年来，随着肿瘤表观遗传学形成机制的研究深入，DNA甲基化作为一种新型分子标志，在肿瘤诊断中的重要性日益受到重视。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的催化下，通过甲基供体S-腺苷甲硫氨酸将一个甲基转移到特定碱基上进行共价修饰。在哺乳动物细胞中，DNA甲基化位于胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的胞嘧啶C-5位上。DNA甲基化状态的改变是癌症进程中最早发生的分子变化之一，且具有组织特异性，肿瘤抑制基因的高甲基化水平已被确定为抑制基因表达和促进癌细胞生长和扩增的重要机制。一些抑癌基因的CpG的高甲基化已被认为是癌症的生物标记之一。因此，肿瘤相关的基因的启动子甲基化是癌症的重要指标，包括癌症的诊断和早期检测，致癌基因的风险预测，癌症预后的预测，治疗后的随诊，抗癌治疗的反应的预测。

Ras相关结构域家族基因1(ras association domain family gene 1，RASSF1)是2000年发现的一种新的抑癌基因，定位于3号染色体短臂2区1带3亚带(3p21.3)。根据mRNA转录过程中不同的选择性剪切和启动子的差异，形成3种主要的转录本，即RASSF1A、RASSF1B和RASSF1C。RASSF1A拥有Ras结构域，Ras结构域与RASSF1A以GTP依赖方式相结合，是RASSF1A蛋白发挥其抑癌作用的关键。其中RASSF1A在正常组织中均有表达，但在胃癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肾癌、前列腺癌和膀胱癌等绝大多数肿瘤中存在较高的表达缺失率。目前认为RASSF1A表达失活主要与启动子区域CpG岛特异的高甲基化、杂合性丢失及染色体缺失有关。研究证明在多种肿瘤细胞中，如：肺癌、乳腺癌、结肠癌及泌尿系肿瘤中有RASSF1A的缺失及高甲基化，胃癌中也有高甲基化的表达。研究发现，RASSF1A启动子区域的高甲基化具有广泛的肿瘤谱。多数相关研究证明启动子区域CpG岛的超甲基化状态是导致RASSF1A的表达失活的机制之一。

现有的DNA甲基化检测方法可归类为限制性内切酶消化、亲和性富集和亚硫酸盐转化3种策略。而基于亚硫酸盐转化的方法是最为广泛研究的，亚硫酸盐能使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶(C)脱氨基转变成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不变。由于尿嘧啶与胸腺嘧啶(T)相似，当进行PCR反应时，在扩增后的产物中变成胸腺嘧啶，而5-甲基胞嘧啶在亚硫酸盐处理过程中不发生改变，经PCR扩增后的产物依然是胞嘧啶，最后对PCR产物进行分析就可判断CpG位点是否发生甲基化。目前开发了很多基于亚硫酸盐转化的DNA甲基化检测方法，例如实时荧光定量甲基化特异性PCR，甲基化敏感高分辨率熔解曲线，毛细管电泳等。虽然这些方法可以准确测定特定CpG位点的甲基化状态，但由于仪器复杂昂贵或操作繁琐，阻碍了这些方法在基层医疗机构的应用和精准医疗的普及。因此，研究并开发一种快速简便，无需大型仪器设备的DNA甲基化检测方法对癌症的诊断以及癌症预后都具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于人RASSF1A基因甲基化检测的特异性引物、试剂盒及方法，克服现有特定CpG位点的甲基化检测方法操作繁琐，检测仪器成本高的技术问题。