[发明专利]一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法

权利要求书

1.一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法，其特征在于：其步骤如下：

(1)制备色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球：

将色氨酸-苯丙氨酸二肽的异丙醇溶液与氯化锌水溶液混合，混合均匀后加入水热反应釜内在70-80℃加热反应55-65min，反应结束后在70-80℃温度下干燥获得色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球，干燥后的色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球复溶于水中，色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球浓度为0.1mg/mL，用于与恩诺沙星核酸适配体互补链偶联，色氨酸-苯丙氨酸二肽与氯化锌的质量比为1：1.5-2.0；溶剂异丙醇与溶剂水的体积比为9：1；

(2)合成二肽荧光纳米微球恩诺沙星核酸适配体互补链偶联物：

向步骤(1)合成的色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶液和cDNA，振荡条件下反应10～12h，反应结束后透析24-26h得到二肽荧光纳米微球恩诺沙星核酸适配体互补链偶联物；所述的色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液的体积质量比为0.8-1.2mL：4mg：4mg；色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球和cDNA的体积质量摩尔比为0.8-1.2mL：0.001μmol；

(3)制备磁性Fe₃O₄微球；

将1,6-己二胺、六水合三氯化铁和无水乙酸钠混合，加入一定体积的乙二醇，搅拌至固体全部溶解，将制得的溶液置于水热反应釜中于加热反应6-8h，反应完成后，自然冷却至室温，取下层黑色固体用无水乙醇和去离子水反复清洗后于60℃下真空干燥10-12h制得磁性Fe₃O₄微球；六水合三氯化铁和乙二醇的质量体积比为1g：30-40mL；

(4)合成磁性Fe₃O₄偶联恩诺沙星适配体偶联物；

将步骤(3)制备的Fe₃O₄分散于磷酸盐缓冲液中，Fe₃O₄与磷酸盐缓冲液的质量体积比为2mg：1mL；超声分散均匀后加入戊二醛反应2-4h，Fe₃O₄与戊二醛(25％)的质量体积比为10mg：1.25mL，磷酸盐缓冲液清洗3-6次除去戊二醛，再次分散于磷酸盐缓冲液，Fe₃O₄与磷酸盐缓冲液的质量体积比为2mg：1mL，加入恩诺沙星核酸适配体反应12-16h，Fe₃O₄与恩诺沙星核酸适配体的质量摩尔比为10mg：0.00015μmol，除去未反应的恩诺沙星核酸适配体后用牛血清白蛋白封闭1h，磷酸盐缓冲液清洗3次去除未吸附的牛血清白蛋白后得到磁性Fe₃O₄偶联恩诺沙星适配体偶联物；

(5)待测样品与步骤(4)合成的磁性Fe₃O₄偶联恩诺沙星适配体偶联物混合；

体积为300-400μL的待测样品与质量为1-1.5mg的磁性Fe₃O₄偶联恩诺沙星适配体偶联物混合，37℃孵育15-20min，磁铁辅助分离去除上清液，用PBS清洗磁性Fe₃O₄偶联恩诺沙星适配体偶联物3-5次；

(6)将步骤(2)中合成的二肽荧光纳米微球恩诺沙星核酸适配体互补链偶联物与步骤(5)中磁性Fe₃O₄偶联恩诺沙星适配体偶联物混合；

向步骤(5)用PBS清洗后的磁性Fe₃O₄偶联恩诺沙星适配体偶联物中加入体积为300-400μL的二肽荧光纳米微球恩诺沙星核酸适配体互补链偶联物溶液，37℃孵育15-20min，测定上清液的荧光强度，对照标准曲线，计算样品中恩诺沙星含量。

2.根据权利要求1所述的一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法，其特征在于：步骤(1)所述的制备的色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球直径2.5-3.0nm。