[发明专利]山羊绒蛋白标记方法及其差异表达蛋白的肽段序列

说明书

本发明公开了一种山羊绒蛋白标记方法，提取绒山羊的绒和毛的蛋白质，测定总蛋白浓度；总蛋白的酶解，记录酶解情况及其蛋白含量，采用高效液相色谱二级质谱方法分析肽段组成和含量；将SWATH质谱获取的肽段数据作为非目标数据，IDA模式的无标记定量方法获取的肽段数据作为目标数据；测定差异表达蛋白含量，利用差异表达蛋白含量进行绒和毛的鉴别。本发明还公开了一种差异表达蛋白的肽段序列。本发明具有高度敏感性、动态范围广、快速的扫描速度、较高覆盖率、成本相对较低、试验操作简便和不受限制。

技术领域

本发明属于纤维鉴别技术领域，具体涉及一种山羊绒蛋白标记方法及其差异表达蛋白的肽段序列。

背景技术

蛋白质组学(Proteomics)是研究蛋白质的结构、功能、组成、表达及其活动规律的一门科学。包括蛋白的定性及定量、蛋白的结构与功能、蛋白翻译后修饰等内容。定量蛋白质组学(Quantitative Proteomics)是对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系内所有蛋白质进行精确鉴定和定量的一门科学。它可用于筛选和寻找任何因素下所引起的样本之间的差异表达蛋白，定量蛋白质组学可分为标记定量组学和非标记定量组学两种。非标记定量即Label-free定量，通常用于分析大规模蛋白的鉴定和定量，不需要对比较样本做特定标记处理，只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号就可得到样品间蛋白表达量的差异。常见方法有IDA(information dependent acquisition)和SWATH(sequential windowed acquisition ofall theoretical fragment ions)。SWATH是较为新颖的一种非标记高通量蛋白定量技术。目前为止，SWATH技术允许完整和永久地记录生物样本中肽前体中所有可检测的碎片离子。在一次进样分析中可以同时得到一个较高质量的定量结果和蛋白质组学样品中每个肽段的数据。这种采集模式将以25Dalton为一个系列区间进行扫描，在扫描范围内通过高速度的扫描可以获得全部离子的所有碎片信息。具有高分辨采集模式的SWATH技术，可以对样品中所有的化合物进行追寻、根源茶渣以及系统分析等相应工作，通过一次实验就可以获得完整的定性定量的结果分析，不需要在进行方法的改善，并通过均匀扫描和采集检测范围内所有前体离子及二级产物离子信息，并依据二级产物离子峰面积进行蛋白质定量的工作。

实现绒毛鉴定的方案有：氨基酸分析法、蛋白质分析法、DNA的分析方法。氨基酸分析法是通过甲酸萃取蛋白质，分析羊绒和绵羊毛纤维中甘氨酸和酪氨酸含量的差异进行鉴定的，但是这种方法数量级差异较小，实验难度大，设备要求高。蛋白质分析法是利用动物纤维中的Ⅱ型角蛋白N-末端和C-末端结构域的物种特异性差异进行纤维鉴别，但是动物纤维中的蛋白质含量会受因同一种属不同个体蛋白质含量的离散性、动物的生长饲养状况、生长时期而产生较大差异，因此检测结果的准确性也会受到影响。DNA的分析方法利用物种特异探针进行DNA点杂交分析到PCR技术的应用以及DNA序列的测定。

目前对羊绒羊毛鉴别的方法主要有：形态特征观察鉴别、溶液浸润和染色鉴别、光谱分析、碱溶度差异分析、结晶结构和热力学学性能分析、摩擦和拉伸性能分析、生物芯片技术等。针对形态特征观察鉴别法，人工观察鳞片结构慢、受主观因素干扰大、导致结果误差大。溶液浸润和染色鉴别法对绒毛本身损伤大、判定精确度有限，鉴别效果并不明显，只适用于纤维宏观形态差异的区分，测试精度有限。光谱分析法，其可靠性在很大程度上取决于建立完善的模型和数据库；检测所得结果很大程度上依赖于所建模型数据库的完整性，数据库要有代表性，并且要有足够的数据积累，否则很容易对检测结果造成不良的影响。碱溶度差异法，需要在特定的试验条件下进行，且耗时长。生物芯片，该方法对纤维要求严格，仅适用于未经过热处理或化学处理的原状态纤维。结晶结构和热力学学性能分析，不同纤维的结晶度以及结晶构成是不同的，X-射线衍射法就是一种利用结晶度来鉴别羊绒和羊毛的一种方法。摩擦和拉伸性能分析，根据羊毛和羊绒纤维表面鳞片的不同特征，对纤维的顺、逆鳞片的动静摩擦系数进行测试，对技术要求较高。

发明内容