[发明专利]引物组合在制备采用双重PCR方法检测牛卵形巴贝斯虫和无浆体的试剂中的应用

说明书

本发明涉及一种引物组合在制备采用双重PCR方法检测牛卵形巴贝斯虫和无浆体的试剂中的应用。本发明根据牛卵形巴贝斯虫AMA1基因(KT312793)保守序列和牛无浆体16S rRNA基因保守序列，设计合成了2对特异性引物P1和P2，将特异性引物序列P1的上、下游引物和特异性引物序列P2的上、下游引物及PCR混合液加入PCR反应管中，混合后加入待测血液样品中提取出来的牛卵形巴贝斯虫DNA及牛无浆体DNA；将PCR管置于PCR扩增仪中进行循环；取PCR产物于1.5％琼脂糖凝胶上电泳。结果表明本发明具有快速、特异、灵敏、高效、低成本等特点，便于临床应用。

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种引物组合在制备采用双重 PCR方法检测牛卵形巴贝斯虫和无浆体的试剂中的应用。

背景技术

牛的卵形巴贝斯虫病(Babesia ovata)是由巴贝斯科巴贝斯属的卵形巴贝斯虫寄生于牛红细胞内所引起的寄生虫病。病牛多表现为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿，多引起死亡。目前牛卵形巴贝斯虫的诊断主要通过血液涂片，显微镜检查为主，隐性感染牛的血液染虫率较低，显微镜检测易出现漏检和误诊。因此，急需建立一种敏感性高、特异性强，用于该病早期诊断。

无浆体病(Anaplasmosis)是由立克次体目(Rickettsiales)、无浆体科(Anaplasmataceae)、无浆体属(Anaplasma)的无浆体引起的一种细菌病。无浆体病在全球范围内分布，是引起畜牧业巨大经济损失和威胁公众健康的重要原因之一。牛无浆体是最常见的感染病原，其引起疾病的临床症状以体温升高、体重降低、虚弱无力、粘膜苍白、淋巴结炎甚至死亡为主要特征。

牛无浆体与卵形巴贝斯虫及其它血液病原体存在混合感染，且其临床症状表现相似。因此，临床症状及血液涂片诊断技术易出现漏诊或误诊的弊端，采用先进的分子诊断技术，如PCR检测具有更高的特异性和敏感性，从而使病原体的诊断更加可靠。双重PCR方法可以在一次PCR扩增中同时特异性地检测 2种病原，更高效省时。因此本发明提供一种引物组合在制备采用双重PCR方法检测牛卵形巴贝斯虫和无浆体的试剂中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种引物组合在制备采用双重PCR方法检测牛卵形巴贝斯虫和无浆体的试剂中的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

本发明提供一种引物组合在制备采用双重PCR方法检测牛卵形巴贝斯虫和无浆体的试剂中的应用，引物包括2对特异性引物P1和P2，其中：

P1：上游引物为5-GATACGGCTGTCGGTAGCAA-3′，下游引物为5-GAGCTGTCACCATTGTCCTTAA-3′；

P2：上游引物5′-GGACTACGGTCGCAAGACTAAA-3′；下游引物为5′-TCCACGATTACTAGCGATTCC-3′。

在上述技术方案中，所述试剂包括PCR扩增体系，所述PCR扩增体系包括： TaqPreMix、引物P1、引物P2、牛基因组DNA模板和重蒸馏水(dd H₂O)。

在上述技术方案中，所述PCR扩增体系为25μL，其中Taq PreMix 12.5μL，引物P1和引物P2各0.5μL，DNA 2μL，dd H₂O 9.5μL。

在上述技术方案中，PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s， 53-60℃退火-延伸30s，30个循环，最后72℃延伸7min。

在上述技术方案中，优选的退火温度为56℃。

本发明的有益效果是：