[发明专利]一种用于同步快速检测荔枝霜疫霉菌和炭疽病菌的双重PCR引物及检测方法

说明书

本发明公开一种用于同步快速检测荔枝霜疫霉菌和炭疽病菌的双重PCR引物及检测方法。所述引物包括PlF1/PlR1和CgF1/CgR1引物对。本发明以含有荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌的样本DNA为模板，在同一个PCR反应体系中加入上述双重PCR引物，经过双重PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，分别得到694bp和286bp的特异扩增产物。利用本组引物建立的针对荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌的双重PCR检测引物及检测方法特异性强、敏感性高、快速准确地在一个体系里同步检测和鉴别荔枝中的两种病原菌，可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴别，有效指导荔枝霜疫霉病及炭疽病的防控。

技术领域

本发明属于植物病原物分子检测技术领域，具体涉及一种用于同步快速检测荔枝霜疫霉菌和炭疽病菌的双重PCR引物及检测方法。

背景技术

荔枝(Litchi chinensis)味佳、色美、营养丰富，被誉为“果中之王”，是热带和亚热带地区水果，分布遍及海南、福建、广西、广东、台湾等省，具有重要经济价值。由霜疫霉菌(Peronophythora litchii)和荔枝炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的荔枝霜疫霉病和荔枝炭疽病是目前荔枝生产上最重要病害，严重影响荔枝产量、品质以及鲜果贮运和外销。这两种荔枝病害目前在福建、广东、广西、海南、云南、台湾等地均有严重发生，其危害的直接后果就是导致荔枝产量和果实品质下降，制约了荔枝产业的发展。这两种病害不仅严重为害接近成熟的果实，也为害嫩梢、叶片、花穗、结果小枝、果柄及幼果，引起大量落果和烂果，产量损失高达80％以上，甚至绝收，造成巨大经济损失。近几年这两种荔枝病害流行频率和流行程度有逐渐加重的趋势，已成为荔枝生产上的一个重要障碍。由于这两种荔枝病害的病原菌虽然不同，但是它们的发病流行条件相似，危害荔枝部位(如接近成熟的果实、嫩梢、叶片、花穗、结果小枝、果柄及幼果)基本一致，早期症状均引起大量落果和烂果，也均具有潜伏侵染的特性。因此，鉴于荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌的巨大破坏性，为防止该病扩散蔓延，建立早期快速检测及鉴定区分引起这两种病害的病原菌，为有效指导病害防控具有重要意义。

植物病原菌的检测方法通常有生物学、血清学和分子生物学等手段。但就荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌而言，由于两种病菌均在荔枝叶片和果实上引起症状，其早期症状上又非常相似之处，单从症状上区别鉴定这2种病害非常困难；血清学具有快速简便、高通量等优点，但对制备抗体的特异性有较高要求；分子检测技术因其快速、灵敏、特异、准确等优点，被广泛应用于植物病原菌的快速检测和鉴定，以及病害的早期检测与诊断中。随着生物技术的发展，基于核酸的多重检测技术在核酸诊断领域发挥了越来越重要的作用，主要包括以多重 PCR、核酸等温扩增、基因芯片为基础的多重核酸检测技术，这些技术可对多个靶标进行同时检测，具有快速、高通量、样品消耗少等特点。多重PCR是一种PCR衍生方法，它的基本原理、反应试剂和操作均与常规PCR相同，区别在于多重PCR体系中含有2对或多对引物，分别扩增不同模板，可对多个靶标进行同时检测。该发明使用的双重PCR(duplexpolymerase chain reaction)是在同一个反应体系对2个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术，能够一次实现对2种病原菌的检测，其特点是耗时短的同时提高准确性和灵敏度。双重PCR技术具有节省时间、降低成本和提高效率的优势，在植物病原菌的鉴定和检测，尤其是对症状类似或病原菌复合侵染的检测中具有广泛的应用前景。

目前，国内外对荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌这2种病菌的分子检测技术已有报道，但是这些研究均只是单独检测一种病菌，目前还未见有同步区分检测荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌的报道，双重PCR技术可在一次反应中同时检测2种病菌，可大幅节约检测时间，提高检测效率，降低检测成本。因此，本领域亟需建立一种简单快速、特异性好、灵敏度高的用于区分检测荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌的双重PCR技术。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提供一种用于同步快速检测荔枝霜疫霉菌和炭疽病菌的双重PCR引物及检测方法。

本发明技术方案主要包括以下内容：