[发明专利]L-谷氨酸亚适量高产菌株及其构建方法与NH4+ 在审
| 申请号： | 202110806044.3 | 申请日： | 2021-07-16 |
| 公开（公告）号： | CN113604412A | 公开（公告）日： | 2021-11-05 |
| 发明（设计）人： | 徐庆阳;刘景阳;张利娟 | 申请（专利权）人： | 天津科技大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/31;C12N15/77;C12P13/14;C12R1/15 |
| 代理公司： | 天津市三利专利商标代理有限公司 12107 | 代理人： | 李蕊 |
| 地址： | 300457 天津市滨*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 谷氨酸 适量 高产 菌株 及其 构建 方法 nh base sup | ||
1.一种L-谷氨酸亚适量高产菌株，其特征在于：为GKG-047(PXT01/Ncgl1221)，是由下述方法得到的：以谷氨酸棒杆菌GKG-047菌体的DNA为模板，将基因组中的通道蛋白Ncgl1221与过表达质粒PXT01重连在一起，使其与质粒一起过量表达，获得Ncgl1221过表达菌株GKG-047(PXT01/Ncgl1221)，其中所述基因Ncgl1221序列为SEQ ID NO.1，所述PXT01的序列为序列表SEQ ID NO.4所示序列。
2.权利要求1所述L-谷氨酸亚适量高产菌株的构建方法，其特征在于：以谷氨酸棒杆菌GKG-047菌体的DNA为模板，将基因组中的通道蛋白Ncgl1221与过表达质粒PXT01重连在一起，使其与质粒一起过量表达，获得Ncgl1221过表达菌株GKG-047(PXT01/Ncgl1221)，其中所述基因Ncgl1221序列为SEQ ID NO.1，所述PXT01的序列为序列表SEQ ID NO.4所示序列。
3.根据权利要求1所述的L-谷氨酸亚适量高产菌株的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)再生基因片段Ncgl1221的制备：以谷氨酸棒杆菌GKG-047菌体的DNA为模板，使用引物Ncgl1221F和Ncgl1221R进行PCR Ncgl1221片段，所述引物Ncgl1221F的序列为序列表SEQID NO.2所示序列，引物Ncgl1221R的序列为序列表SEQ ID NO.3所示序列；
(2)过表达重组质粒的构建：对过表达质粒PXT01用KpnⅠ和EcoRⅠ进行双酶切线性化，然后将再生的基因片段Ncgl1221与线性化后的PXT01进行同源重组连接，构成过表达重组质粒；
(3)将过表达重组质粒化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05μg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落；摇管培养，并提取出重组质粒PXT01(Ncgl1221)；
(4)将重组质粒导入到谷氨酸棒杆菌GKG-047的感受态菌株中；
(5)将提出的重组质粒PXT01(Ncgl1221)电转到谷氨酸棒杆菌GKG-047的感受态菌株中并涂布于0.05μg/mL浓度的氯霉素抗性平板，32℃培养24小时；挑选单菌落进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检验PCR片段长度是1590-1620，即为导入重组质粒后的目的菌株GKG-047(PXT01/Ncgl1221)，同时将挑选出的菌株用体积分数为20％的甘油保藏。
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