[发明专利]一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法

说明书

本发明公开了一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法，属于烟草的多倍体育种技术领域，包括无菌苗培育、离体嫁接、嫁接结合部位愈伤诱导、不定芽诱导和生根培养、再生植株移栽、再生植株表型筛选鉴定和倍性鉴定等步骤。本发明采用红花栽培烟草与黄花烟草作为嫁接亲本材料，利用试管离体嫁接技术实现烟草基因组水平转移；利用人工组织培养技术，实现两个嫁接亲本的嫁接接合愈伤组织诱导及无性株系再生，克服了两种近缘烟草种间有性育种障碍，并形成可育的烟草异源多倍体植株。

技术领域

本发明涉及烟草的多倍体育种技术领域，更具体地说，涉及一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法。

背景技术

异源多倍体是来自两个不同物种的基因组的组合，是物种进化主要来源，许多现代作物植物的优异性状是通过异源多倍体化途径获得，如普通烟草的形成就是林烟草与绒毛状烟草杂交后，经染色体自然加倍形成的异源四倍体。越来越多的研究发现，不同物种的细胞紧密接合时会诱发遗传物质的水平转移，即受体生物通过无性方式从供体生物获得遗传物质的过程，有别于世代繁衍过程中的有性传递方式。水平基因转移又称横向基因转移，新基因对物种的起源、演化及对环境的适应性具有重要作用，而水平基因转移作为物种引入新基因的一条重要途径，水平基因转移能跨越种间隔离，在亲缘关系远或近的生物有机体间都可以进行遗传信息转移。可以使受体生物绕过点突变和重组快速形成新物种，加速基因组的革新和进化，提高生物遗传多样性。砧木和接穗在愈伤组织、细胞壁、维管组织的重建过程中伴随着遗传物质在细胞间的转移。植物间的嫁接可以导致DNA片段或者整个质体基因组的交流。嫁接接合部位通过离体培养诱导愈伤组织产生的不定芽则被称之为嫁接嵌合体；嵌合体诱导技术能够克服远缘或近缘间植物有性育种障碍，并形成可育的异源多倍体。异源多倍体可以通过无性机制发生，嫁接可作为一种创制新异源多倍体的快速方法。

目前，由于烟草育种长期选用较单一的栽培品种作为亲本进行品种间杂交选育新品种，导致国内栽培烟草种质间亲缘关系较近、遗传基础狭窄、遗传多样性较低，是目前烟草育种面临的突出问题。烟草远缘杂交是实现将野生烟草中显性抗病虫基因直接转移到普通栽培烟草的有效途径。因此，拓宽和丰富烟草栽培种的遗传基础，发掘烟草属野生种的遗传潜力，创制携带有优良基因的骨干亲本材料是烟草育种亟待解决的问题。然而，烟草种间普遍存在生殖隔离，如普通红花烟草和黄花烟草，普通红花烟草与大部分野生烟草均存在严重的生殖隔离。因此，如何有效克服普通红花烟草与黄花烟草或野生烟草的有性杂交不亲和是目前烟草远缘杂交育种亟需解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法，本发明采用红花栽培烟草与黄花烟草作为嫁接亲本材料，利用试管离体嫁接技术实现烟草基因组水平转移；利用人工组织培养技术，实现两个嫁接亲本的嫁接接合愈伤组织诱导及无性株系再生；克服两种近缘烟草种间有性育种障碍，并形成可育的异源多倍体。

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案：

一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法，该方法包括如下步骤：

(1)无菌苗培育：在组培室中将红花烟草种子和黄花烟草种子预处理后分别播种于含固体培养基的培养皿中，培养两周后将生长至小十字期的幼苗移植至含有固体培养基的培养瓶中，把培养瓶放入组培室中每天光照培养16小时，每天黑暗培养8小时，待红花烟草植株和黄花烟草幼苗植株生长至株高5-10cm后作为嫁接亲本；

(2)离体嫁接：将步骤(1)中得到的嫁接亲本进行交互嫁接得到嫁接体，将得到的嫁接体置于MS培养基中培养2-4周至嫁接结合部位融合完好，得到结合部位具有维管组织的接穗植株，所述接穗植株可正常生长；

(3)嫁接结合部位愈伤诱导：切下步骤(2)中得到的接穗植株上的嫁接结合部位，用刀片将嫁接紧密结合部位横切成多块薄片，将每块薄片分别平放于含有愈伤固体培养基的培养瓶中培养25d，进行愈伤组织诱导，得到多块愈伤组织块；