[发明专利]苹果黄蚜Tre基因及其核酸干扰剂制备方法与应用

权利要求书

1.一种核酸干扰剂，其特征在于：所述核酸干扰剂的主效成分为dsTre，所述核酸干扰剂配方为：在主效dsRNA水溶液中加入2%v/v脂肪醇聚氧乙烯醚、1%v/v的氮酮、0.5%v/v的NP-10，所述dsTre为Tre基因的cDNA片段合成的特异性dsRNA，所述Tre基因为苹果黄蚜致死基因，所述Tre基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述dsTre的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.一种权利要求1所述的一种核酸干扰剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：根据Tre基因的cDNA序列合成特异性引物，以苹果黄蚜整虫cDNA为模板，进行PCR扩增获得扩增产物，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到纯化的目的DNA片段；

步骤2：将目的DNA片段合成为目的dsRNA，获得核酸干扰剂的主效成分；

步骤3：将获得的dsRNA与渗透剂进行混配，得到可喷洒使用的核酸干扰剂。

3. 根据权利要求2所述的一种核酸干扰剂的制备方法，其特征在于：所述步骤1中的特异性引物包括上游引物以及下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

4. 根据权利要求2所述的一种核酸干扰剂的制备方法，其特征在于：所述步骤1中的PCR扩增反应体系为：25 μL 2×Taq PCR Master Mix，2 μL cDNA模板，2 μL上游引物，2 μL下游引物，19 μL ddH₂O ；

PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3 min，然后进入下述循环：94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35次循环；最后在72℃下延伸10 min。

5.根据权利要求2所述的一种核酸干扰剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2具体为：将所述DNA片段通过Promega dsRNA合成试剂盒进行合成；

dsRNA合成反应体系为：8 μL 100 mM dNTP，1 μg DNA，2 μL 10×Reaction Buffer，2μL T7 RNA Polymerase Mix，加ddH2O补足到总体积为20 μL；

dsRNA 合成PCR反应条件为：37℃，4 h；70℃，10 min；25℃，20 min。

6.根据权利要求2所述的一种核酸干扰剂的制备方法，其特征在于：所述步骤3中可喷洒使用的核酸干扰剂配方为：2%v/v脂肪醇聚氧乙烯醚、1%v/v的氮酮、0.5%v/v的NP-10。

7.一种如权利要求1所述的一种核酸干扰剂在防治苹果黄蚜中的应用。