[发明专利]一种犹素探针的合成方法

说明书

本发明属于蛋白质化学合成技术领域，具体涉及一种犹素探针的合成方法，包括以下步骤：采用多肽固相合成技术分别制备犹素N端酰肼片段和犹素C端酰肼片段；采用多肽酰肼连接反应偶联所述犹素N端酰肼片段和犹素C端酰肼片段得到犹素酰肼；将所述犹素酰肼进行原位活化和氨解反应，得到所述犹素探针。本发明采用全合成制备犹素酰肼，经酰肼的原位氧化和氨解的“一锅法”获得犹素探针，具备普适性高、操作简单、合成效率高、易功能化修饰、可大量制备等优点。

技术领域

本发明属于蛋白质化学合成技术领域，具体涉及一种犹素探针的合成方法，该犹素探针可用于共价交联去修饰酶。

背景技术

犹素(UFM1)是存在于真核生物中的一种保守的类泛素蛋白，含有83个氨基酸。经犹素相关酶E1、E2、E3催化的级联反应，犹素C端甘氨酸会与蛋白底物的赖氨酸侧链形成酰胺键(也被称为异肽键)，从而形成犹素化修饰，进而调控底物蛋白的结构和功能。相似于其它翻译后修饰，犹素化也是动态可逆的过程，其异肽键可被去犹素化酶所特异性水解。

研究表明犹素化参与DNA损伤修饰、基因转录、内质网稳态、细胞自噬、凋亡等细胞过程，其功能紊乱也被证明与肿瘤、精神分裂症、缺血性心脏病、糖尿病等密切相关。近年来多种犹素化的蛋白底物(如p53、组蛋白等)被相继鉴定，且数量上呈现逐年递增的趋势，但相应的酶催化体系却较为单一，如目前已知具备活性的人源去犹素化酶仅存在一种。犹素底物类型和数量的多样化与去犹素化酶的单一性预示着对犹素修饰系统的认识仍存在很大空白，比如是否存在其它未知的去犹素化酶，酶与不同底物间的选择性识别作用，去犹素化过程的酶催化机制等基础问题仍有待回答。

特异性靶向酶活中心的活性探针被认为是研究去犹素化酶的有效分子工具，在分子结构上由纯化标签、犹素、活性基团三部分组成，其原理为在犹素分子C端(异肽键附近)装配亲电基团，犹素作为识别单元与相应的去犹素化酶发生相互作用，此时去修饰酶不再水解酰胺键，其活性中心的半胱氨酸与亲电基团会发生加成或取代反应，进而形成底物-酶的共价交联复合物，从而达到共价捕获蛋白酶的目的。该类型的探针具备多方面的应用价值，包括1)从细胞裂解液中富集纯化并结合蛋白质组学等技术发现新型去犹素化酶；2)分析疾病细胞中活性异常的去修饰酶而发现潜在的药物靶点；3)监测酶抑制剂的活性和选择性以发现潜在的药物分子；4)捕获并稳定去修饰酶的催化构象以促进底物 -酶复合物的结构解析。

C端炔丙胺修饰的犹素探针(tag-UFM1-PA)被证明与去犹素化酶存在很好的交联活性，呈现广泛的应用前景，但其难以通过蛋白质重组表达或酶法进行制备，而目前已建立的全合成或半合成方法存在合成效率低或普适性差等不足。因此，开发更为简单、高效的犹素探针的化学合成方法将有利于推动去犹素化酶相关的机制研究，也为犹素修饰相关的靶点鉴定及抑制剂开发提供必需的探针分子。

发明内容

本发明旨在提供一种犹素探针(His₆-UFM1-PA)的合成方法，具备普适性高、易功能化修饰、操作简易、可大量制备等特点。

按照本发明的技术方案，所述犹素探针的合成方法，所述犹素探针为 His₆-UFM1-PA(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)，包括以下步骤，

步骤1：采用多肽固相合成技术分别制备犹素N端酰肼片段和犹素C端酰肼片段；

步骤2：采用多肽酰肼连接技术偶联所述犹素N端酰肼片段和犹素C端酰肼片段得到犹素酰肼；

步骤3：将所述犹素酰肼进行原位活化和氨解反应，得到所述犹素探针。

进一步的，所述犹素N端酰肼片段为His₆-UFM1[S²-A⁴⁵]-NHNH₂，所述犹素C端酰肼片段为UFM1[C⁴⁶-V⁸²]-NHNH₂。

进一步的，所述步骤1的具体操作如下：