[发明专利]一种基于荧光相关光谱检测有机溶剂诱导蛋白聚集的药物筛选方法

说明书

本发明涉及一种基于荧光相关光谱检测有机溶剂诱导蛋白聚集的药物筛选方法，荧光标记的蛋白在含有有机溶剂的水溶液中产生聚集现象，当待筛化合物与蛋白发生相互作用时，会抑制蛋白在含有有机溶剂的水溶液中产生聚集现象，通过荧光相关光谱检测荧光标记蛋白聚集体的特征扩散时间（扩散系数），获得蛋白与待筛化合物相互作用的强弱信息，从而实现基于有机溶剂诱导蛋白聚集的药物筛选，该方法检测体积小、灵敏度高。本发明可针对常见疾病与突发性疾病的临床药物进行筛选，大大减少药物筛选时间和成本，为药物研发提供了更加简单、快速和普适性强的方法。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种基于荧光相关光谱检测有机溶剂诱导蛋白聚集的药物筛选方法。

背景技术

新药的开发及其药理研究对改善人类健康至关重要。在药理学研究中，药物-靶标蛋白相互作用分析是促进新药发现和发展精准药物的关键步骤。药物的治疗效果在很大程度上取决于其靶位的结合。目前，已经开发了多种研究药物-靶标蛋白相互作用的方法。如质谱、核磁共振、毛细管电泳、全内反射荧光，荧光偏振和荧光共振能量转移等。然而，开发样品用量少、快速和高灵敏的方法用于研究未标记药物分子与靶标蛋白之间的相互作用仍然是一个巨大的挑战。

荧光相关光谱(fluorescence correlation spectroscopy，FCS)是一类具有超高灵敏度的单分子光学检测方法。荧光相关光谱系统通过对检测微区(1fL)内的荧光分子由于布朗运动或者化学反应造成的荧光信号的涨落进行记录，然后对荧光涨落信号进行自相关函数分析，得到荧光分子的荧光相关光谱曲线，获取其浓度、特征扩散时间、化学反应速率常数、结合和解离常数等信息。由于FCS作为一种单分子光学分析技术，具有样品用量少、灵敏度高和分析速度快等特点，因此被广泛应用于在蛋白-蛋白和蛋白-药物等相互作用研究中。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于荧光相关光谱检测有机溶剂诱导蛋白聚集的药物筛选方法。以解决了传统体外药物筛选方法体系复杂和疗效相关性差的问题，建立了一种基于荧光相关光谱检测有机溶剂诱导蛋白聚集的药物筛选模型。

还解决了传统体外筛药方法耗时长和成本高等问题，应用该方法可在单分子水平进行快速和低成本的药物筛选，为临床前抗肿瘤药物评价提供了一种新的方法。在肿瘤研究、抗肿瘤药物开发等领域具有重大应用前景。该方法简单、经济和具有普适性。

本发明通过以下技术方案来实现发明目的：

本发明的原理是，采用荧光标记蛋白在含有有机溶剂的水溶液中产生聚集现象，然而当加入的药物分子与蛋白发生相互作用时，会抑制蛋白在含有有机溶剂的水溶液中产生聚集现象，通过荧光相关光谱检测荧光标记蛋白的特征扩散时间实现蛋白与药物分子相互作用强弱的监测，从而实现基于有机溶剂诱导蛋白聚集的药物筛选。其原理是当加入有机溶剂后蛋白产生聚集，其聚集体分子量变大，粒径也变大，在溶液中的扩散速度变慢，该聚集体的特征扩散时间变长，然而当蛋白与待筛药物分子发生强的相互作用时，该药物分子抑制蛋白在含有有机溶剂的水溶液中聚集，因此蛋白的聚集程度大大降低，其分子量相对聚集体分子量变小，粒径也变小，在溶液中的扩散速度变快，该蛋白的特征扩散时间变短，本发明的技术方案为：一种基于荧光相关光谱检测有机溶剂诱导蛋白聚集的药物筛选方法，具体包括如下步骤:

步骤一、蛋白的荧光标记和纯化，将荧光分子与蛋白共价连接。用超滤膜纯化标记溶液，用荧光相关光谱表征荧光分子-蛋白标记物，在一定的条件下，测定其特征扩散时间。

步骤二、蛋白与药物分子相互作用，将不同浓度待筛化合物加入荧光标记的蛋白溶液中温育一定时间。

步骤三、有机溶剂诱导蛋白聚集，在上述蛋白-药物水溶液中加入有机溶剂浓度至5％-50％。同时设置不加入待筛化合物的对照组。