[发明专利]一种新型基因编辑系统及相关载体和方法

说明书

本发明公开了一种新型基因编辑系统及相关载体和方法。本发明公开的基因编辑系统含有pegRNA、MCP与逆转录酶形成的融合蛋白，pegRNA为由sgRNA、逆转录模板、引物结合位点、源自噬菌体MS2的RNA茎环结构依次连接得到的RNA分子，RNA茎环结构的序列为序列表中序列1或2，MCP为序列14的第11853‑12233位或序列13的第12‑401位编码的蛋白质。使用本发明的系统，进行基因编辑，尤其是植物基因编辑，可以显著提高先导编辑的效率，提高精准编辑效率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种新型基因编辑及相关载体和方法。

背景技术

精确的基因组编辑技术在作物育种和基因组功能研究中发挥着重要作用。2019年10月出现的精准基因编辑新工具PE(Prime Editors)为基因编辑领域带来了重大突破(Anzalone,Randolph et al.)。新工具PE以CRISPR-Cas9系统为基础，建立PE1系统，一方面将Cas9切口酶(H840A)与野生型逆转录酶(M-MLV)融合形成新的融合蛋白，另一方面改造单链引导RNA(sgRNA)，在其3’末端增加一段含有新遗传信息的逆转录模板(rtT)和引物结合位点(PBS)序列以获得先导编辑引导RNA(pegRNA)；在PE1系统的基础上，通过优化M-MLV逆转录酶的氨基酸序列，改善其热稳定性，建立PE2系统。PE系统在不引入双链断裂(DSB)和无需供体DNA模板情况下，可有效实现12种单碱基的自由转换和多碱基的精准插入与删除。

2020年，国内已有多组科研团队相继发表文章阐述该先导编辑系统在植物的应用，但其编辑效率仍有待进一步提高(Lin,Zong et al.2020)。因此，需要开发出一种能显著提高先导编辑效率的方法，以提高该系统的可用性和友好度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何对DNA进行精确编辑，并提高精确编辑效率。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种DNA先导编辑系统，所述系统含有pegRNA，所述pegRNA为由sgRNA、逆转录模板、引物结合位点、源自噬菌体MS2的RNA茎环结构依次连接得到的RNA分子，所述RNA茎环结构的序列为如下a1)-a4)中的任一种：

a1)序列表中序列1；

a2)序列表中序列2；

a3)在a1)或a2)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA序列；

a4)与a1)或a2)或a3)的RNA序列具有70％以上的同一性的RNA序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的a1)或a2)的核苷酸序列具有70％或更高，75％或更高，85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述70％以上同一性，可为70％、75％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述系统还可含有MCP与逆转录酶(M_MLV)形成的融合蛋白，所述MCP为可以特异性结合MS2茎环结构的衣壳蛋白。

具体的，所述MCP可为如下P1)、P2)、P3)或P4)：

P1)序列14的第11853-12233位编码的蛋白质；

P2)序列13的第12-401位编码的蛋白质；

P3)将P1)或P2)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

P4)在P1)或P2)或P3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。