[发明专利]一种检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括已包被抗体的酶标板、酶标抗体，所述包被抗体为鼠源抗分拣微管连接蛋白17单克隆抗体，酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体。

2.如权利要求1所述的检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被抗体的浓度为2μg/mL，酶标抗体的稀释比例为1:400。

3.如权利要求1所述的检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品、样品稀释液、洗涤液、TMB显色液、反应终止液。

4.如权利要求3所述的检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为1×磷酸盐缓冲液，洗涤液为0.05％PBST溶液，反应终止液为2M H₂SO₄。

5.如权利要求1所述的检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测对象为人血清或组织匀浆。

6.如权利要求1至5任一项所述的检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品的制备：将人分拣微管连接蛋白17质粒转化入表达菌，向表达菌中加入诱导剂诱导人分拣微管连接蛋白17表达，然后从诱导表达的菌液中提取表达得到的人分拣微管连接蛋白17、纯化、透析、冷冻干燥得到人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品；

(2)抗体的包被过程：将鼠源抗分拣微管连接蛋白17单克隆抗体包被酶标板，孵育、封闭，即得已包被抗体的酶标板；

(3)酶标抗体的制备：采用改良NaIO₄标记法制备辣根过氧化物酶标记的兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体；

(4)组装试剂盒：将步骤(2)的已包被抗体的酶标板、步骤(3)的酶标抗体与步骤(1)得到的人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品、样品稀释液、洗涤液、TMB显色液、反应终止液组装成ELISA试剂盒。

7.如权利要求6所述的检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)人分拣微管连接蛋白17质粒由以下过程得到：将菌液中带有His标签载体为PET-28A的人分拣微管连接蛋白17原核表达质粒进行质粒扩增、提取，即得人分拣微管连接蛋白17质粒。

8.如权利要求6所述的检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)改良NaIO₄标记法制备辣根过氧化物酶标记的兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体的过程为：

a.将辣根过氧化物酶溶于双蒸水中，向其中加入NaIO₄溶液，室温搅拌得到棕绿色溶液1；

b.向步骤a得到的溶液1中加入乙二醇放置后得到蓝色溶液2，置于醋酸钠缓冲液中透析过夜；

c.向透析后的溶液2中加入Na₂CO₃缓冲液调节溶液pH为9-9.5，立即加入兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体多克隆抗体得到溶液3，放置过夜；

d.向溶液3中加入NaBH₄溶液，放置后得到溶液4，然后进行透析过程；

e.向透析后的溶液4中加入中性甘油，得到辣根过氧化物酶标记的兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体。

9.如权利要求6所述的检测人分拣微管连接蛋白17的ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，所述包被抗体的浓度及酶标抗体的稀释比例的筛选过程为：

a.将鼠源抗分拣微管连接蛋白17单克隆抗体稀释至不同浓度，包被酶标板，每一浓度分别包被三个纵、横行；

b.甩干酶标板中的包被抗体，加入5％牛血清白蛋白封闭过夜；

c.将人分拣微管连接蛋白17蛋白标准品稀释至不同浓度作为抗原液，分别加入到步骤b的酶标板的横行中进行孵育；

d.甩干抗原液，洗涤，向步骤c的酶标板纵行中加入不同稀释比例的辣根过氧化物酶标记的兔源抗分拣微管连接蛋白17多克隆抗体进行孵育；

e.甩干酶标抗体，洗涤，向酶标板每孔加入TMB显色液、反应终止液，酶标仪读取OD值，筛选得到包被抗体的浓度和酶标抗体的稀释比例。