[发明专利]酵母菌株及其在石油烃降解中的应用

说明书

本发明涉及生物修复技术领域，尤其涉及酵母菌株及其在石油烃降解中的应用。本发明提供了经基因改造的解脂耶氏酵母，该重组酵母菌株能够表达烷烃转运蛋白酶，从而提高了对烷烃的降解能力，特别是对长链烷烃的降解能力。配合本发明优化后的降解条件，该菌株对长链烷烃的降解率可达60％以上。

技术领域

本发明涉及生物修复技术领域，尤其涉及酵母菌株及其在石油烃降解中的应用。

背景技术

随着人类对石油及其产品需求量的日益增加，油田附近的湿地面临着石油污染加剧的严重威胁，其污染物主要是在原油开采、运输、石化燃料的生产使用及事故性泄露中所产生的石油污染物。烃类化合物是石油产品的主要成分，按照其骨架结构的不同分为饱和链烃(烷烃)、不饱和链烃(烯烃和炔烃)、脂环烃和芳香烃，其中烷烃占石油产品主要成分的50％以上。因此，在石油污染物中，烷烃是最常见的污染物。在自然环境中，短链烷烃易挥发，中链烷烃可以被微生物降解，而不易挥发、低溶解性的长链烷烃则属于很难被生物降解的污染物，对环境的危害较持久。因此，微生物的降解作用是实现石油污染湿地中长链烷烃去除的有效途径。

生物修复是一种符合绿色发展理念的主要修复方式，并逐渐成为研究重点。生物修复石油烃污染环境大致可以分为以下三个过程，微生物对石油烃的间期适应过程、转运过程和降解过程。在生物修复石油烃污染环境的过程中，微生物首先会对石油烃进行间期适应过程，在此过程中微生物一般通过分泌表面活性剂和趋化运动两种方式增大对石油烃污染物的生物利用度；然后，石油烃经过转运过程进入细胞内，主要方式有自由扩散、被动运输、主动运输和内吞作用，且大部分石油烃的转运过程需要转运蛋白的参与；最后，石油烃在细胞内完成降解，石油烃分子一旦进入细胞内，即被加氧酶氧化为脂肪族醇，脂肪族醇依次转化为脂肪族酸和脂酰辅酶A等，随后经β-氧化降解。

但现有的石油烃降解菌研究集中在细菌领域，而大部分石油烃降解细菌遗传背景不清楚，且降解效果较为有限。因此，进一步提高菌种对石油烃的降解效率仍是本领域的研究热点。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种能够提高石油烃降解率的酵母菌株及其在石油烃降解中的应用。

本发明提供了表达烷烃转运蛋白的解脂耶氏酵母。

长链烷烃在水相中的溶解度非常低，因此烃降解菌必须采取某些特定的摄取模式才能获取这些疏水性底物。烷烃通过特异性转运蛋白转运到细胞中。有研究表明，长链烷烃(C₁₄～C₁₆)需要烷烃转运蛋白ABC1才能进入细胞或输出，以防止烷烃毒性。然后它们被细胞色素P450依赖的烷烃单加氧酶系统(ALK基因编码)转化为相应的脂肪醇，然后被脂肪醇脱氢酶(FADH基因)转化为醛，并被脂肪醛脱氢酶(FALDH)转化为相应的长链脂肪酸。解脂耶氏酵母降解长链烷烃途径如图1所示。

本发明中，所述烷烃转运蛋白为解脂耶氏酵母ATCC 201249的烷烃转运蛋白。具体的，其编码的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

构建本发明所述解脂耶氏酵母的表达载体为K8FB载体或PINA1269载体。其中，K8FB为单拷贝载体(图谱如图9，序列如SEQ ID NO:4)，PINA1269载体为多拷贝载体。

本发明中，用于构建重组菌株的底盘菌为解脂耶氏酵母ATCC 201249。

本发明提供的重组菌株以解脂耶氏酵母为底盘进行基因改造，通过K8FB、pINA1269质粒使菌株表达烷烃转运蛋白酶基因(ABC1)，进一步提高了解脂耶氏酵母对烷烃降解的能力，并且结果表明，以pINA1269质粒为载体表达ABC1蛋白更有利于石油烃的降解。

本发明所述重组菌株的构建方法包括：将编码ABC1蛋白的核酸片段通过同源重组的方法构建入表达载体；以限制性内切酶对构建后的表达载体进行线性化；将线性化的载体以同源重组的方式整合入底盘菌。

本发明构建的解脂耶氏酵母在石油烃降解中的应用。