[发明专利]神经干细胞联合脐带间充质干细胞在脊髓损伤中的应用

权利要求书

1.人诱导多能干细胞来源的神经干细胞(NSC)联合人脐带来源的间充质干细胞(MSC)作为治疗动物急性脊髓损伤产品的应用；

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：通过将人诱导多能干细胞体外分化为NSC、人脐带分离培养为MSC，并辅以辅料得到治疗动物急性脊髓损伤产品，并将获得的产品原位移植到急性脊髓损伤的脊髓；

所述人诱导多能干细胞来源的神经干细胞(NSC)联合人脐带来源的间充质干细胞(MSC)比例按照1:1的比例使用的，溶媒物用的是PBS。

3.一种治疗动物急性脊髓损伤产品，其特征在于：包括比例为1:1的人诱导多能干细胞来源的神经干细胞(NSC)联合人脐带来源的间充质干细胞(MSC)的细胞混合产品。

4.如权利要求3所述的一种治疗动物急性脊髓损伤产品，其特征在于：所述人诱导多能干细胞体外分化为NSC通过人外周血单个核细胞重编程为诱导多能干细胞，干细胞在神经诱导剂作用下，体外分化为神经干细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中；

在分化为神经干细胞的过程中，用37℃预热的神经诱导培养基隔天换液，共培养七天，第八天可将细胞消化传代，得到P0 NSC。

5.如权利要求3所述的治疗动物急性脊髓损伤产品，其特征在于：所述人脐带分离培养为MSC，包括以下步骤：

S1：使用组织块法贴壁分离脐带间充质干细胞，并使用无血清培养基培养，使用差速贴壁法纯化细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中；

S2：在培养皿上进行随机直线划痕，以便固定华通胶，并在超净台中干燥5～10min，加入3～5ml无血清培养基，每1～3天续加2～3ml培养基，观察细胞迁移及生长状况；

S3：传代培养：在传代细胞融合度至85～95％时，继续传代培养，传代过程中将细胞悬液放入培养皿，放入培养箱中静置5～10min，将悬液中的细胞重新放入新的培养皿中，将已经贴壁的细胞弃去；

S4：冻存：将部分细胞离心后以3-4×105/mL放入1ml冻存液中，放入程序性冻存盒中，置于-80℃冰箱内；

S5：建立脐带间充质干细胞的数据库，并使该数据库与冻存细胞进行关联。

6.如权利要求5所述的治疗动物急性脊髓损伤产品，其特征在于：所述S3中培养的条件为：置于37℃，5％CO2培养箱中；

7.如权利要求5所述的治疗动物急性脊髓损伤产品，其特征在于：所述S4中的冻存液成分包括：70％无血清培养基，20％胎牛血清(Thermo Fisher)，10％二甲基亚砜(Sigma)。