[发明专利]非洲猪瘟病毒CD2v截短蛋白及在制备野毒和自然弱毒检测试剂盒中的应用

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了非洲猪瘟病毒CD2v截短蛋白及在制备野毒和自然弱毒检测试剂盒中的应用。通过比对发现原核表达的CD2v截短蛋白作为ELISA包被抗原不能检测到非洲猪瘟病毒感染的阳性血清，而真核表达的CD2v蛋白作为ELISA包被抗原可以检测非洲猪瘟病毒感染的阳性血清。以真核表达CD2v蛋白作为包被抗原制备的间接ELISA试剂盒，同时配合以非洲猪瘟病毒p54蛋白为包被抗原的间接ELISA试剂盒，可用于鉴别ASFV野毒株和自然弱毒株的感染，操作步骤简单，结果可靠。因此，以本发明提供的真核表达的截短蛋白制备的非洲猪瘟病毒间接ELISA检测试剂盒非常适合临床大样本的检测，适合大规模推广。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒CD2v截短蛋白及在制备野毒和自然弱毒检测试剂盒中的应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African SwineFeverVirus，ASFV)引起的猪的一种急性、烈性和高度接触性的动物传染病，其临床症状主要表现为皮肤充血发绀、内脏器官严重出血、发病率高、死亡率高、病程短。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物A类动物疫病，我国将此病规定为一类动物传染病。2018年ASFV传入我国，给我国养殖业造成巨大的经济损失，随着病毒的传播，田间出现了突变弱毒株，该毒株潜伏期更长，造成的损失更为严重，因此检测该毒株的存在对ASFV的防控显得至关重要。

非洲猪瘟EP402R基因编码CD2v蛋白，是一种重要的病毒糖基化蛋白，在病毒感染的细胞中，CD2v有三种表达形式，分别是89kDa的全长糖基化蛋白，及通过蛋白水解作用产生的大小为63kDa的N-末端糖基化片段和大小约为26kDa的C-末端非糖基化片段。非洲猪瘟病毒粒子通过该蛋白凝集猪的红细胞，进而随着血液的流动在全身组织器官中大量扩增传播，在培养的原代细胞中，CD2v蛋白可以导致猪红细胞形成玫瑰花环状，这种玫瑰花环实验也是判定ASFV滴度的一种实验方法，因此该蛋白在病毒毒力方面发挥着重要作用。

国家非洲猪瘟专业实验室对2020年6月至12月非洲猪瘟与流行病学进行了调查，成功分离到22株非洲猪瘟病毒，测序发现其中有11株病毒发生了突变或缺失，这些突变或缺失导致病毒CD2v蛋白翻译提前终止，不能编码出完整有功能的CD2v蛋白。CD2v是病毒吸附红细胞活性(HAD)所必须的蛋白质，通过HAD实验证实所有CD2v蛋白翻译提前终止的突变株均丧失红细胞吸附能力。田间非洲猪瘟CD2v突变或缺失弱毒株不能够表达CD2v，失去了对猪红细胞吸附的现象，导致病毒的毒力减弱。但值得注意的是，虽然CD2v突变或缺失自然弱毒株致病力较典型强毒株明显降低，但仍然呈现明显的残留毒力，具有很强的水平传播能力，会在田间猪群中广泛传播，造成持续性感染、慢性病毒程甚至死亡。非洲猪瘟CD2v缺失或突变自然弱毒株的逐渐流行，给ASFV的诊断带来巨大障碍，为我国非洲猪瘟防控带来全新挑战。目前，主要基于实时荧光定量PCR的方法来检测非洲猪瘟自然弱毒株和野毒株的感染，还没有商品化针对非洲猪瘟CD2v突变或缺失自然弱毒株和野毒株的鉴别诊断ELISA试剂盒，然而由于自然弱毒株的毒力弱，有时表现出隐形感染或间歇性排毒，导致通过实时荧光定量PCR的方法在某些情况下存在漏检等，从而不能及时发现，给疫病的控制带来巨大的挑战。非洲猪瘟病毒自然弱毒株侵入机体后会产生相应的抗体，因此通过ELISA实验检测猪只产生的抗体可以完美的避开检测不到病毒核酸这一难题，及时发现猪群中是否存在自然弱毒株，尽早剔除，防止猪群大面积感染，将非洲猪瘟病毒防控的时间缩短，减少不必要的经济损失。所以，以该蛋白作为包被抗原建立的ELISA检测方法再配合以p54蛋白为包被抗原建立的ELISA检测方法，可用于鉴别非洲猪瘟自然弱毒株和野毒株感染。