[发明专利]一种提高大肠杆菌工程菌合成2’-岩藻糖基乳糖产量的方法

说明书

本发明公开了一种重组菌株，所述重组菌株是将重组质粒pETDuet‑vgb‑manC‑B和pCDFDuet‑gmd‑fcl‑wcfB‑lacY共转化到大肠杆菌获得。本发明还公开了重组菌株的构建方法和该重组菌株在发酵生产2’‑FL中的应用。本发明通过设计RBS序列，以适中的水平表达透明颤菌血红蛋白VHB的编码基因vgb，成功抑制了重组JM109(DE3)菌株的乙酸分泌，又避免了VHB带来的细胞毒性，使得发酵获得的菌浓度OD₆₀₀和2’‑FL产量大幅提高，具有很强的应用价值。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种提高大肠杆菌工程菌合成2’-岩藻糖基乳糖产量的方法。

背景技术

母乳概念一直是配方奶粉的发展方向，尤其是女性产假偏少、认识不足等客观原因导致近年来我国母乳喂养率不断走低，更需要开发母乳类添加剂。尽管我国配方奶粉生产水平不断提高，但对母乳成分的添加不够重视。国外特别是欧洲国家在母乳类添加剂上的研究历史悠久，早在上世纪90年代就已经开展了生物技术合成人乳寡糖的研究，成功研发了2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose，本文简称2’-FL)和乳糖-N-新四糖的生物合成方法。

2’-岩藻糖基乳糖的结构如下：

其中2’-FL是母乳中重要的活性成分，它具有以下功效：(1)促进肠道益生菌的繁殖、抑制有害菌生长。人摄入2’-岩藻糖基乳糖后，由于其结构稳定不会被胃酸以及消化酶破坏，因此可以直接到达大肠部位，促进肠道中的双歧杆菌和乳酸菌生长。(2)抗病原菌粘附作用。肠道病原菌入侵人体后的第一步通常是在上皮细胞定殖，随后开始感染组织。2’-岩藻糖基乳糖的结构恰好与肠道上皮细胞上的糖蛋白、糖链部分结构相似，因此可以诱骗病原菌与其结合而不与肠道上皮细胞结合，从而阻断其定殖过程。(3)对免疫系统进行调节，降低炎症反应。研究表明，2’-岩藻糖基乳糖可以直接参与细胞因子的分泌调节来影响免疫系统，例如在婴儿体内可以降低炎症细胞因子(IL-lra、IL-1α、IL-lβ、IL-6、肿瘤坏死因子-α)浓度，这与母乳喂养结果基本一致；而普通奶粉喂养组则出现炎症细胞因子显著上升的情况。基于以上研究，商业机构预测2’-FL是未来最为重要的婴幼儿配方奶粉添加剂之一，产业规模可能超过DHA(二十二碳六烯酸)等经典产品。2’-FL项目目前已经产业化并获得了欧盟的生产许可证，雀巢等公司将其添加到自身产品中销售，这表明2’-FL的应用前景光明。2’-FL的生产主要依靠重组大肠杆菌，通过将2’-FL合成基因簇克隆到BL21(DE3)、或JM109(DE3)、或BL21star(DE3)等菌株，以葡萄糖、或甘油、或蔗糖为碳源，以乳糖为合成前体，经过高密度发酵获得大量2’-FL。如何提升2’-FL产量成为当前研发的热点问题，以JM109(DE3)菌株为例，在发酵过程中会产生大量乙酸，严重影响了菌株生长与2’-FL合成。

发明内容

发明目的：本发明的目的是通过生物工程技术，提高大肠杆菌基因工程菌的细胞密度以及2’-FL终产量，本发明所要解决的技术问题是在JM109(DE3)菌株中表达透明颤菌血红蛋白VHB，并在高密度发酵中获得更高的2’-FL产量。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组菌株，所述重组菌株是将重组质粒pETDuet-vgb-manC-B和pCDFDuet-gmd-fcl-wcfB-lacY共转化到大肠杆菌获得。

其中，所述重组质粒pETDuet-vgb-manC-B是将连接有特殊RBS序列的vgb基因克隆到pETDuet-1质粒上获得重组质粒pETDuet-vgb，然后将基因簇manC-B克隆到pETDuet-vgb上获得重组质粒pETDuet-vgb-manC-B。