[发明专利]一种仿刺参育种全基因组50K SNP芯片及应用

权利要求书

1.一种仿刺参育种全基因组50K SNP芯片,其特征在于：所述的SNP芯片包括用于仿刺参育种的SNP标记组合以及用于仿刺参育种的液相育种芯片，所述用于仿刺参抗高温性状育种的SNP标记组合，由48755个SNP位点组成，SNP所在核苷酸序列分别为SEQ No.001-SEQID No.48755所示序列，长度为49bp，所述用于仿刺参育种的液相育种芯片，由48755对探针序列，每个SNP位点对应两条探针序列，分别为Forward探针和Reverse探针。

2.根据权利要求1所述的一种仿刺参育种全基因组50K SNP芯片，其特征在于：所述的仿刺参全基因组育种芯片在不同群体仿刺参的遗传背景分析中的作用。

3.根据权利要求1所述的一种仿刺参育种全基因组50K SNP芯片，其特征在于：所述的仿刺参全基因组育种芯片在仿刺参性状关联分析中的应用。

4.根据权利要求1所述的一种仿刺参抗高温育种低密度12K SNP芯片，其特征在于：所述一种仿刺参抗高温育种低密度12K SNP芯片在抗高温性状的全基因组选择育种值分析中的应用。

5.根据权利要求1-4所述的一种仿刺参育种全基因组50K SNP芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、在1.5ml的管中加入500ul STE裂解缓冲液，50ul 10％SDS,3.5ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K，16ul浓度为100mg/ml的RNase A，所述裂解缓冲液包括100mM NaCl、pH8.0的10mMTris-Cl以及pH8.0的1mM EDTA，取扇贝闭壳肌0.1克，加入，剪碎，研磨棒研磨，研磨至絮状，56℃处理2h，期间每隔30mins颠倒混匀一次，最终裂解液澄清状态，加入500ul的Tris饱和酚，100ul体积比例为24：1的氯仿/异戊醇，轻轻晃动20min，室温12000rpm离心10分钟；

S2、抽取上清液至新的1.5ml的EP管中，加入300ulTris饱和酚，300ul体积比例为24：1氯仿/异戊醇，轻轻晃动20mins,室温12000rpm离心10分钟，重复步骤S2两至三遍，直至无蛋白层为止；

S3、抽取上清，加入等体积500ul氯仿/异戊醇，轻轻晃动20min，室温8000rpm，常温离心10分钟，取上清加入1ml的冰无水乙醇，50ul醋酸钠(3M)，-20℃放置40min，12000rpm离心10min，使核酸沉淀，弃上清，浓度为70％乙醇洗涤沉淀2次，每次8000rpm低温离心5min，干燥至乙醇全部挥发，加入30ul ddH2O溶解，再加0.75uL RNase于37℃消化RNA 1.5h，利用Qubit试剂盒进行对DNA进行定量，浓度为1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，提取的DNA放置在-20℃保存备用；

S4、利用Covaris破碎仪将提取的仿刺参基因组DNA进行打断处理，打断范围设置在350bp，利用基因组DNA建库试剂盒进行DNA片段的末端修复加A，然后两端连接上接头后进行扩增，利用带有Barcode的引物进行文库扩增，完成文库的构建，利用Qubit 2.0进行文库定量，在Illumina HiSeq X Ten PE150平台进行测序，使用Bwa软件的index命令、samtools的index命令、picard的CreateSequenceDictionary.jar构建参考序列的索引，利用Bwa-mem命令将双末端测序reads进行比对，生成bam文件，利用samtools的sort命令进行排序，生成排序的bam文件，利用Picard MarkDuplicates.jar命令，通过设置参数REMOVE_DUPLICATES＝true来丢弃duplicated序列，利用Samtools index对每个个体生成的bam文件建立索引，使用GATK软件中适用于群体变异检测的HaplotypeCaller模块对所有的样本进行变异检测，所述GATK软件中适用于群体变异检测的HaplotypeCaller模块对所有的样本进行变异检测具体包括使每样本生成一个gvcf文件，然后再进行群体的joint-genotype，依据群体的变异信息校正个体的变异和基因型数据；

S5、挑选出二态性SNP位点，过滤掉10bp window内超过3的SNP位点；过滤QD2.0,FS20.0,MQ40.0,DP6.0,DP1000.0,MQRankSum-12.5,ReadPosRankSum-8.0的低质量SNP位点；过滤最小等位基因小于0.05的位点。最后得到高质量967万SNP，进行下一步低密度SNP选择；

S6、筛选出不同群体共有SNP，然后在这些共有SNP中减少或删除处于高连锁不平衡的SNP，采用LD的R20.35作为删除SNP尺度，根据Wright的FST、SNP基因频率的平均欧式距离以及信息熵，构建具有约束条件下SNP选择最优化模型，利用R软件优化求解包，获得SNP基因频率含有高信息量SNP，且SNP能较均匀分布基因组上，对已克隆的仿刺参重要生长，抗高温性状相关基因的与功能相关的SNP位点，利用GWAS关联分析，通过GWAS Pval值得到与皮重、抗高温性状相关显著的SNP位点，使用SnpEff[179]软件对高质量的SNP进行注释，确定SNP所在的基因元件，及对氨基酸的变化影响；

S7、选择SNP位点上游22bp的碱基序列及下游22bp序列作为位点的特异探针，按照以下HD-Marker探针设计原则进行侧翼探针的设计和评估：

·侧翼探针序列需要满足GC含量在40％-60％之间

·Tm值在55～65℃之间

·侧翼探针内不能有超过5个连续碱基的区域

·侧翼序列匹配度在80％以上的区域不能大于5处

·探针侧翼序列内的变异位点个数不超过3

选取符合设计标准的位点数目为48755，对通过设计标准的位点信息进行整合，形成了一个包含位点信息、探针序列以及注释信息的HD-marker液相芯片池。芯片上来源于基因区上的位点22778个，覆盖的基因数目为6955个，基因间区的位点为25977个，将上游探针的5’端和下游探针的3’端都分别连接一段22bp的Illumina平台测序通用的引物序列，形成Forward探针和Reverse探针，将所有位点的Forward探针集合形成一个Forward探针池，所有位点的Reverse探针集合形成一个Reverse探针池，合成Forward探针池和Reverse探针池获得48k位点的液相芯片池。