[发明专利]阻碍细菌保守区域逆转录的探针组合物及其应用

说明书

本发明提供一种阻碍细菌保守区域逆转录的探针组合物，包括针对16S rRNA和23SrRNA序列保守性区域的96条探针，序列如SEQ ID NO.1‑96所示，每条探针能够结合不低于10％的常见细菌rRNA，能够特异高效地识别并结合这些靶细菌rRNA的保守序列区域，并阻碍这些区域RNA的逆转录，同时保留非保守区域rRNA的正常逆转录。使用本发明公布的细菌rRNA逆转录探针进行RNA mNGS检测具有操作简单(一步操作)、耗时短(2min)、损失小和成本低等优点，并显著提升了RNA mNGS检测技术的有效数据占比、检出率、灵敏度和准确性，非常适用于RNA mNGS的自动化检测。

技术领域

本发明专利涉及一种阻碍细菌保守区域逆转录的探针组合物及其在RNA建库中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

病原微生物检测在感染性疾病的诊断中极为重要，而传统的检测方法主要有分离培养和生化鉴定、涂片镜检、免疫学方法、PCR检测、基因芯片技术，这些只能对已知的病原微生物进行检测，而无法对未知的症状进行有效的诊断。随着肠道微生物和病原微生物领域的兴起，许多疾病或症状是多种微生物共同作用的结果。因此，高通量基因组学技术和高通量转录组学技术被用于系统鉴定病理学样本中的微生物种类，为病原微生物致使疾病的诊断提供了强大的诊断工具，被称为宏基因组新一代测序技术(metagenomics nextgeneration sequencing,mNGS)。这种技术是一种无需培养，无偏好性，直接提取临床样本中DNA/RNA，采用高通量测序技术，经过数据库比对与生信分析，一次性完成细菌，真菌，病毒和寄生虫等病原体的检测。但是对于病原微生物中细菌核糖体RNA所占比例较大，并且在这些rRNA在细菌中高度保守，这就导致很难区分这些相同的区域是来源哪一种病原菌同时也占据了测序数据，使得有效的数据较少。这不仅提高了测序的数据量和测序成本，也降低了病原微生物检出的效率和准确性。

发明内容

本发明的目的是提供一种阻碍细菌保守区域逆转录的探针组合物，每条探针能够结合不低于10％的常见细菌rRNA，能够特异高效地识别并结合这些靶细菌rRNA的保守序列区域，并阻碍这些区域RNA的逆转录，同时保留非保守区域rRNA的正常逆转录。

本发明采用的技术方案为：一种细菌16S rRNA保守区域逆转录的探针组合物，其特征在于，为下表所示的探针混合物

优选的，所述探针序列中斜体下划线部分的碱基为LNA修饰碱基，3’端-NH ₂C ₆封闭。

本发明还公开了一种细菌23S rRNA保守区域逆转录的探针组合物，其特征在于，为下表所示的探针混合物

优选的，所述探针序列中斜体下划线部分的碱基为LNA修饰碱基，3’端-NH ₂C ₆封闭。

本发明还公开了上述的探针组合物在RNA建库中的应用。

本发明的作用机理：在逆转录缓冲液中，在高温条件下让样本总RNA分子接触探针组合物和随机引物，以使探针与其中的rRNA分子优选形成RNA:DNA的杂交双链，获得高温杂交混合物。

将获得的高温杂交混合物降温，在低温条件下让总RNA分子接触探针组合物和随机引物，以使随机引物与其它RNA分子形成RNA:DNA的杂交双链，获得低温杂交混合物；探针组合物经锁核酸修饰后Tm值和结合稳定性远高于随机引物，因此探针组合物可以在高温条件下与rRNA结合。而随机引物Tm值很低，只能在低温条件下与其它RNA结合。

将上述步骤中生成低温杂交混合物接触逆转录酶，生成一链cDNA。生成一链cDNA过程中rRNA无法被逆转录酶作为模板延伸而被去除；