[发明专利]一种基于自增强发光材料和亚甲基蓝的双信号同时获取的比率适配体传感器的构建方法

权利要求书

1.一种基于自增强发光材料和亚甲基蓝的双信号同时获取的比率适配体传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）自增强复合材料的制备：

首先，将柠檬酸铵加入到超纯水中，常压下进行加热反应，反应过程中，溶液的颜色从无色变为黄色时，再调节pH，得到氮掺杂石墨烯量子点溶液，记为NGQDs溶液；

然后，通过混合曲拉通X-100、环己烷、1-己醇和水，此时得到混合溶液A；然后向混合溶液A中加入三联吡啶钌溶液，并搅拌一段时间后，加入正硅酸四乙酯和氨水来引发聚合反应，反应结束后，加入丙酮使得纳米颗粒沉淀，然后再分别用乙醇和超纯水洗涤离心，离心后的产物经烘干后得到干燥产物，记为Ru@SiO₂；

随后将Ru@SiO₂用乙醇溶解，得到Ru@SiO₂溶液；然后在Ru@SiO₂溶液中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷搅拌反应后，用乙醇洗涤离心后并烘干，得到粉末状的氨基功能化的Ru@SiO₂，记为NH₂-Ru@SiO₂；

最后，将NH₂-Ru@SiO₂溶解在超纯水中，得到NH₂-Ru@SiO₂溶液，将其与NGQDs混合，搅拌反应结束后，透析，得到的橙黄色溶液，记为NRS溶液，室温避光储存；

（2）将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末处理，然后依次在水、乙醇、丙酮和水中超声清洗并晾干，得到处理后的玻碳电极；

（3）将步骤（1）制备得到的NRS溶液滴加到经步骤（2）处理后的玻碳电极表面，室温下晾干，得到的产品标记为NRS/GCE；

（4）将壳聚糖溶液修饰在步骤（3）所制得的NRS/GCE传感器表面，并晾干；此时，传感器表面形成一层膜结构，标记为CS/NRS/GCE；

（5）根据ZEN适配体的已知序列及碱基互补配对原则设计ZEN适配体互补DNA，记为cDNA，所述cDNA的浓度为1 μM，将cDNA修饰在步骤（4）所获得的传感器表面，cDNA与壳聚糖之间的静电吸附作用使其被固定在电极表面，并用PBS对传感器进行淋洗，淋洗后的传感器标记为cDNA/CS/NRS/GCE；

设计的ZEN适配体互补DNA的碱基对序列包含以下五种，分别记为cDNA-1、cDNA-2、cDNA-3、cDNA-4和cDNA-5，具体序列如下：

cDNA-1：5′- ATA GAT GA-3′

cDNA-2：5′-TAC CAT AGA TAG ATG A-3′

cDNA-3：5′-TAG TAA TGT ACC ATA GAT AGA TGA-3′

cDNA-4：5′-ATT ACA GAT AGT AAT GTA CCA TAG ATA GAT GA-3′

cDNA-5：5′-CAT ATC ACA TTA CAG ATA GTA ATG TAC CAT AGA TAG ATG A-3′；（6）将牛血清白蛋白（BSA）修饰在步骤（5）得到的电极表面，以封闭壳聚糖表面的非特异性结合位点，同时用PBS淋洗，淋洗后的传感器记为BSA/cDNA/CS/NRS/GCE；

（7）将ZEN的适配体（ZBA）修饰在步骤（6）所获得的传感器表面，利用其与cDNA的杂交反应形成双链DNA；然后用PBS进行淋洗，淋洗后的传感器记为ZBA/BSA/cDNA/CS/NRS/GCE；

（8）将步骤（7）所获得的传感器放在亚甲基蓝（MB）溶液中浸泡，所述亚甲基蓝溶液的浓度为0.1~20 μM；浸泡后用超纯水淋洗，得到基于NRS和MB的自增强电化学发光-电化学双方法的比率适配体传感器，标记为MB/ZBA/BSA/cDNA/CS/NRS/GCE；

（9）在步骤（8）所制得的传感器表面修饰不同浓度的ZEN标准溶液，一个浓度的ZEN溶液对应修饰一个传感器，浓度和传感器呈一一对应关系；孵育一段时间后，用PBS淋洗，从而获得基于自增强发光材料和亚甲基蓝的双信号同时获取的比率适配体传感器，标记为ZEN/MB/ZBA/BSA/cDNA/CS/NRS/GCE。