[发明专利]抗鸡传染性法氏囊病毒的四价高亲和力抗体及其制备和应用

说明书

本发明公开了抗鸡传染性法氏囊病毒的四价高亲和力抗体及其制备和应用。本发明提供的两种抗鸡传染性法氏囊病毒的四价高亲和力抗体基因，并将两种携带抗鸡传染性法氏囊病毒的四价高亲和力抗体基因的真核表达载体分别转染进入CHO‑K1细胞，利用流式细胞仪多次筛选得到高表达抗鸡传染性法氏囊病毒的四价高亲和力抗体的细胞。本发明提供的两种含抗鸡传染性法氏囊病毒的四价高亲和力抗体基因的CHO细胞株所表达的重组蛋白可以预防和治疗鸡传染性法氏囊病，为鸡传染性法氏囊病的预防和治疗提供一个候选药物，将在鸡传染性法氏囊病的预防和治疗史上开辟了一个新的局面。

技术领域

本发明涉及“抗鸡传染性法氏囊病毒的四价高亲和力抗体及其制备和应用”属于生物技术领域。

背景技术

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBDV主要侵害3-12周龄的雏鸡和青年鸡，损伤鸡的中枢免疫器官——法氏囊，具有传播速度快、传染性强、感染率及死亡率均高的特点。该病目前在全球范围内均有分布，是养禽业最重要疾病之一，并且因免疫失败而造成的经济损失巨大。

目前，预防IBD的主要方法是接种疫苗。但常用的预防IBD的疫苗是中等毒力疫苗，会对接种鸡的法氏囊造成不同程度的损伤，导致免疫抑制，从而可增强机体对其它病原体的易感性并且降低对其它疫苗的反应性。所以很多鸡场，特别是小型鸡场选择卵黄抗体来预防和治疗IBD，但是，卵黄抗体除了产品质量难控制、其水平和垂直传播疾病的问题也受到越来越多的关注。在IBD的预防工作中，迫切需要一种可以预防和治疗IBD的本动物源的四价高亲和力的抗体。随着基因工程技术的发展，使基因工程抗体技术应运而生。目前，本动物同源四价抗体产品在兽医领域尚属空白，本发明旨在研制出具有预防和治疗IBD的鸡源重组四价高亲和力的抗体。

四价全长抗体含有完整的恒定区区域，在生物表达过程中经过细胞器严格的加工修饰才能使其具有高亲和力以及与抗原特异性结合能力，因此，对其生产从质和量上的要求就更加的严格，表达系统的选择也至关重要。原核生物不含蛋白加工修饰的众多细胞器，因此，大肠杆菌表达系统只可以用于生产体积小、结构简单、不需要糖基化的抗体片断如Fab、Fab'、scFv等；低等真核生物表达系统，如酵母及丝状真菌，可用于全长抗体的生产，但其糖基化类型与哺乳动物相比存在差异，如酵母糖基化类型为多麦芽糖类型，该类型糖蛋白抗体半衰期较短、生理活性有限甚至对人体有毒性。在蛋白修饰的系统中最接近人体的是哺乳动物表达系统，该系统可以对蛋白进行适当的折叠、装配和翻译后修饰，在临床应用中占主导地位，目前，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells，CHO cells)是最理想的真核表达宿主，通过该系统表达的蛋白在构型和构象上更接近于天然蛋白，是重组糖基化蛋白生产的首选体系。

目前，获FDA批准的抗体药物中许多是由CHO细胞生产的，CHO-K1细胞是可以悬浮生长的谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷型细胞，因此，转染后的CHO细胞可运用共扩增基因进行筛选，即在表达载体上游加入GS基因作为筛选标记，同时利用GS抑制物甲硫胺酸亚砜(L-Methionine sulfoxide，MSX)进行加压筛选，随培养基中MSX浓度的逐渐增加，GS基因带动与之串联在一起的外源基因共同转录，使目的基因的转录效率增加，从而实现外源基因的高效表达。由于GS筛选标记不能够直观的监测及分选阳性细胞，因此，本发明在轻链的下游引入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因，EGFP是GFP的突变体，具有更高的荧光强度，在488nm波长光激发下可产生绿色荧光，从而通过流式细胞仪进行检测和分选。

本发明将两种本动物源高亲和力四价全长抗体(结构示意图见图1和图2)，分别转染CHO细胞，筛选出能够稳定表达抗IBDV的鸡源重组四价高亲和力抗体的细胞株。本发明获得了两种抗鸡传染性法氏囊病毒的本动物源四价高亲和力的重组抗体，通过动物实验表明两种四价抗体具有预防和治疗鸡传染性法氏囊病的效果。本发明为兽医领域研制本动物源四价治疗性抗体建立了平台，为推动动物治疗性抗体的产业化奠定了基础。