[发明专利]一种响应非生物胁迫的顺式作用元件及其鉴定方法和应用有效
申请号: | 202110836570.4 | 申请日: | 2021-07-23 |
公开(公告)号: | CN113621612B | 公开(公告)日: | 2023-03-14 |
发明(设计)人: | 胡萍;杨传平;张凯敏 | 申请(专利权)人: | 江西省科学院生物资源研究所 |
主分类号: | C12N15/113 | 分类号: | C12N15/113;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/00 |
代理公司: | 南昌丰择知识产权代理事务所(普通合伙) 36137 | 代理人: | 吴称生 |
地址: | 330000 江西*** | 国省代码: | 江西;36 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 响应 生物 胁迫 顺式 作用 元件 及其 鉴定 方法 应用 | ||
本发明属于植物基因工程技术领域,公开了一种响应非生物胁迫的顺式作用元件及其鉴定方法和应用,顺式作用元件的核苷酸序列为“AGCCT”,并提供了含有权利要求1所述的顺式作用元件的植物报告载体。本发明所述顺式作用元件的启动子片段能够被富集,且在盐和渗透胁迫条件下的富集程度加强。可见所述新顺式作用元件参与白桦非生物胁迫应答,可用于白桦抗逆性改良。
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域,具体涉及一种响应非生物胁迫的顺式作用元件的鉴定及其在植物抗逆性改良中的应用。
背景技术
高盐、干旱和低温等非生物胁迫是植物在生长发育过程中遭受的主要逆境因子,植物对逆境的抵御涉及复杂的生理生化反应和一系列相关功能基因的表达,这就要求转录因子作为调控网络的主开关发挥作用。转录因子通过与顺式作用元件结合来调控下游基因的表达,在逆境胁迫反应中发挥重要作用。因此,鉴定转录因子识别的顺式作用元件,可以揭示参与环境适应的转录调控机制和基因表达模式,进一步加深对转录因子功能的认识及植物逆境胁迫应答的分子机制解析。
科研人员基于酵母单杂交技术建立了一套以转录因子为中心鉴定其识别的顺式作用元件的技术体系,该技术可以快速、准确地鉴定转录因子所识别的各种顺式作用元件,主要用于鉴定特定转录因子结合的新顺式作用元件。
白桦(Betula platyphylla)具有生长迅速、适应性和抗逆性强等特点,是研究耐盐抗旱机理的理想材料。目前,已经在白桦中克隆得到一些抗逆相关转录因子基因,其中,白桦BpRAV1转录因子基因被发现参与了白桦非生物胁迫应答过程,但 BpRAV1转录因子调控白桦非生物胁迫应答的分子机制尚未阐明。鉴定BpRAV1转录因子识别的非生物胁迫响应顺式作用元件,将有助于揭示BpRAV1转录因子参与胁迫应答的转录调控机制。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题,本发明的目的是提供一种响应非生物胁迫的顺式作用元件。本发明的另一目的是提供所述新顺式作用元件在白桦抗逆性改良中的应用。
为了实现上述发明目的,本发明采用下述技术方案:
一种响应非生物胁迫的顺式作用元件,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,核苷酸序列为“AGCCT”。
一种响应非生物胁迫的顺式作用元件的鉴定方法。
(1)、随机DNA文库的筛选:利用转录因子为中心的酵母单杂交技术体系,以效应载体pGADT7-Rec2-BpRAV1为诱饵,筛选随机DNA插入序列文库。从TDO+50mM 3- AT培养基上挑取阳性酵母克隆,提取pHIS2质粒并测序,从而鉴定出一个BpRAV1识别的不包含任何已知元件的插入序列“CCAAGCCTCCGGG”;
(2)、插入序列中核心元件的鉴定:为确定BpRAV1结合的这一新序列的核心序列,将插入序列“CCAAGCCTCCGGG”分别从左、右边界依次删除,将每个缺失序列以3 次串联拷贝克隆到pHIS2中,通过酵母单杂交实验研究其与BpRAV1的相互作用;酵母单杂交实验结果显示,BpRAV1能与序列“AGCCTCCGG”结合,但未能与“GCCTCCGG”结合;另外,BpRAV1可以与序列“CCAAGCCT”结合,但不能与“CCAAGCC”结合;表明 BpRAV1结合的顺式作用元件是“AGCCT”。
一种植物报告载体,其含有所述顺式作用元件。
将“AGCCT”及其突变序列的3次串联拷贝分别与35S CaMV小启动子序列融合,经酶切、连接反应使融合序列定向替换掉pCAMBIA1301载体中的CaMV 35S启动子,即获得瞬时表达的报告载体;将BpRAV1构建到pROK2植物表达载体CaMV 35S启动子的下游,用作共转化的效应表达载体。
所述的顺式作用元件在提高白桦抗逆性中的应用,用于白桦抗逆性改良。
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