[发明专利]一种小RNA定量检测方法

权利要求书

1.一种用于非疾病诊断和治疗目的的小RNA定量检测方法，该方法通过poly(A)加尾的小RNA逆转录得到cDNA，然后采用Taqman探针法对所述的cDNA进行实时定量PCR扩增检测得到目标小RNA的表达情况，其特征在于，用于逆转录的逆转录引物的序列组成为：5’-标签序列-Oligo dT-互补序列-3’，其中，所述的互补序列与目标小RNA 3’端碱基互补，所述的标签序列无茎环结构，所述的标签序列与待检测样品中所有序列均不互补，所述的标签序列GC含量为40％～60％，所述探针的序列与所述的标签序列的一段相同，

所述的小RNA定量检测方法用于同时检测多种目标小RNA的表达情况，不同的所述的逆转录引物的5’端的所述的标签序列不同，不同的探针使用不同的标记物。

2.根据权利要求1所述的小RNA定量检测方法，其特征在于，所述的互补序列长度为4～8个碱基，

和/或，所述的Oligo dT的长度为6～20个碱基，

和/或，所述的标签序列的长度为10～150个碱基。

3.根据权利要求1所述的小RNA定量检测方法，其特征在于，所述的标签序列的长度为15～100个碱基，所述的Oligo dT的长度为8～15个碱基，所述的互补序列的长度为4～6个碱基。

4.根据权利要求1所述的小RNA定量检测方法，其特征在于，用于所述的实时定量PCR扩增检测的反向引物的序列包括所述的标签序列的全部或部分。

5.根据权利要求1所述的小RNA定量检测方法，其特征在于，适用于所述的小RNA定量检测方法的待检测样品包括总RNA、纯化的小RNA或合成的小RNA。

6.根据权利要求1所述的小RNA定量检测方法，其特征在于，所述的小RNA包括miRNA、siRNA或ncRNA中的一种或多种。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的小RNA定量检测方法，其特征在于，所述的小RNA定量检测方法具体包括：

(1)在poly(A)聚合酶的作用下，待检测样品中小RNA的3’端加上一段poly(A)序列，得到poly(A)加尾的小RNA；

(2)步骤(1)中所得的poly(A)加尾的小RNA在所述逆转录引物的作用下逆转录形成cDNA；

(3)采用Taqman探针法对步骤(2)中所得的cDNA进行实时定量PCR扩增检测，得到目标小RNA的表达情况。

8.根据权利要求7所述的小RNA定量检测方法，其特征在于，

所述步骤(1)的反应条件为35～40℃，20～40min；

所述步骤(2)的反应条件为37～52℃，20～40min。

9.根据权利要求7所述的小RNA定量检测方法，其特征在于，

所述步骤(1)的反应体系包括待检测样品、poly(A)聚合酶、ATP、poly(A)加尾缓冲液；

所述步骤(2)的反应体系包括经步骤(1)反应后的待检测样品、所述逆转录引物、逆转录酶、逆转录缓冲液、dATP、dTTP、dCTP、dGTP。

10.根据权利要求1至6中任一项所述的小RNA定量检测方法，其特征在于，所述的poly(A)加尾与所述的逆转录在同一个反应体系中进行，所述的小RNA定量检测方法具体包括：

(1)配制poly(A)加尾、逆转录反应体系，所述的poly(A)加尾、逆转录反应体系包括待检测样品、poly(A)聚合酶、逆转录引物、逆转录酶、逆转录缓冲液、ATP、dTTP、dCTP、dGTP、dATP；

(2)所述的加尾、逆转录反应体系于35～40℃下反应20～80min，或先于35～40℃下反应20～40min，然后于40～52℃下反应20～40min得到cDNA；

(3)采用Taqman探针法对步骤(2)中所得的cDNA进行实时定量PCR扩增检测，得到目标小RNA的表达情况。

11.一种小RNA定量检测试剂盒，其特征在于，所述的小RNA定量检测试剂盒包括逆转录反应试剂、PCR反应试剂，

所述的逆转录反应试剂中含有逆转录引物，所述的逆转录引物的序列组成为：5’-标签序列-Oligo dT-互补序列-3’，其中，所述的互补序列与所述的目标小RNA 3’端碱基互补，所述的标签序列无茎环结构，所述的标签序列与待检测样品中所有序列均不互补；所述的标签序列GC含量为40％～60％，所述的PCR反应试剂中含有正向引物、反向引物以及探针，

所述的正向引物的序列与目标小RNA逆转录后的序列互补，

所述的反向引物的序列包括所述的标签序列的全部或部分，

所述探针的序列与所述的标签序列的一段相同，

所述的小RNA定量检测方法用于同时检测多种目标小RNA的表达情况，不同的所述的逆转录引物的5’端的所述的标签序列不同，不同的探针使用不同的标记物。