[发明专利]一种生物标志物CA15-3的Simoa试剂盒及其使用方法

说明书

本发明涉及免疫检测技术的一种生物标志物CA15‑3的单分子阵列检测(Simoa)试剂盒及其使用方法。所述Simoa试剂盒基于Simoa平台单分子阵列技术和双抗体夹心法检测人体液中糖类抗原(CA15‑3)蛋白含量，包括捕获抗体包被的磁珠、CA15‑3标准品、生物素化的检测抗体、SBG溶液、荧光底物溶液和样本稀释液。所述Simoa试剂盒灵敏度达到0.0048U/mL，上样量仅需1‑2μL，重复性好，检测范围为0.005‑10U/mL，能够准确检测人体液中CA15‑3含量。

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，特别是指一种生物标志物CA15-3的Simoa试剂盒及其使用方法。

背景技术

糖类抗原CA15-3(Carbohydrate Antigen 15-3，CA15-3)是一种由腺体上皮分泌的糖蛋白，在多种腺癌中都有发现，临床上主要用来检测乳腺癌，卵巢癌以及肺腺癌。当肿瘤增生或者转移时，分泌上皮细胞上的CA15-3进入血液中使CA15-3水平上升，因此可以作为一种血清学检测标志物作为临床诊断依据。

目前临床上使用的CA15-3检测方法主要是酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。其中，酶联免疫分析法是最常见的一种方法，但是该方法灵敏度较低，重复性差，操作时间长，容易出现假阳性。化学发光免疫分析法是比较成熟的传统分析方法，但一直也存在着发光时间短，易水解，信噪比低，稳定性差以及重复性低等缺点。

单分子阵列(Single molecule array,Simoa)技术又称为数字ELISA，是基于磁珠的蛋白质超灵敏检测方法。在传统双抗体夹心ELISA中，酶-底物反应的荧光产物扩散至约50-100μL的大体积，需要依赖数百万酶标记的免疫复合物在背景之上产生可测量的荧光信号。在数字ELISA中，酶-底物反应的荧光产物被限制在46飞升(fL)大小的微孔中，其被称为单分子阵列(Simoa)。使用该方法，可以检测单个酶分子的存在。在Simoa免疫测定中，将抗体包被的捕获珠过量加入含有低浓度靶蛋白分子的样品中。基于泊松分布原理，一个或零个目标蛋白质分子将与每个磁珠结合。结合多于一个蛋白质分子的磁珠可以忽略不计。然后将磁珠与生物素化的检测抗体和链霉亲和素-β-半乳糖苷酶一起孵育，形成酶标记的免疫复合物。接着，将磁珠载入到46fL的微孔阵列上，其中每个孔仅能够容纳一个磁珠。用荧光底物填充微孔并用全氟油密封。含有单一免疫复合物的珠子将导致许多底物分子经酶催化产生大量荧光产物。由于荧光产物被限制在约46fL的极小体积，结合荧光显微成像技术即可实现单个微孔的荧光成像，从而实现单个蛋白分子的检测。以这种方式，Simoa可以使用数字读数模式定量蛋白质浓度，并实现超过4个数量级的检测范围。

因此，基于Simoa技术开发一种高灵敏度、自动化程度高、快速、准确性好且适合推广的CA15-3检测方法，对快速检测生物标志物CA15-3具有重大的意义。

发明内容

一种生物标志物CA15-3的Simoa试剂盒，所述Simoa试剂盒包括捕获抗体包被的磁珠、CA15-3标准品、生物素化的检测抗体、SBG溶液、荧光底物溶液和样本稀释液。

本发明的技术方案是这样实现的：

所述捕获抗体包被的磁珠的制备方法为：

(1)将捕获抗体通过超滤管进行换液处理；

(2)将2.7μm磁珠用EDC进行活化；

(3)于4℃条件下，将步骤(1)处理的捕获抗体与步骤(2)活化的磁珠混合孵育2-3h；

(4)经步骤(3)孵育的产物用PBST溶液洗两次后，用封闭液于37℃封闭，最后用磁珠稀释液洗两次，即获得捕获抗体包被的磁珠，于磁珠稀释液中储存。

所述步骤(1)中捕获抗体为单克隆抗体L10085；超滤使用的缓冲液是为50-60mmol/mL吗啉乙磺酸缓冲液，pH＝6.2-6.4。