[发明专利]一种包被纤维蛋白原的蓝染羊膜基底膜的制备方法

权利要求书

1.一种包被纤维蛋白原的蓝染羊膜基底膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、羊膜基底膜的制备：将羊膜用含有0.3wt％氧氟沙星的无菌磷酸盐缓冲盐水PBS冲洗羊膜，去除血液和杂质，

将羊膜与质量浓度为2.5％的胰蛋白酶混合，在37℃条件下孵育6小时，用细胞刮刀刮除羊膜的浆膜和部分基质，

再将羊膜浸泡在质量浓度为0.3mg/mL的明胶酶IV中，在37℃条件下孵育3小时，消化剩余的羊膜基质和致密层，并用无菌PBS冲洗两次，

然后将羊膜浸泡在质量浓度为0.02％的乙二胺四乙酸EDTA中，在37℃条件下孵育2小时，然后轻轻刮擦去除羊膜上皮，得到处理后的羊膜基底膜，并将其放置在培养基中，贮存在-80℃条件下，

通过光学和扫描电子显微镜检查羊膜基底膜，以确定羊膜上皮、浆膜、间质及部分致密层均从羊膜基底膜中完全移除，将预先制备的羊膜基底膜进行多种病毒的蛋白链式反应PCR；

S2、羊膜基底膜的染色：将羊膜基底膜以台盼蓝或亮蓝染色；

S3、纤维蛋白原包被：将人血浆制品中的纤维蛋白原均匀喷涂在染色后的羊膜基底膜表面；

所述步骤S3纤维蛋白原包被所使用的喷涂装置为设有两个进口的喷枪(1)，所述喷枪(1)的第一进口依次与三通阀(2)、冷凝蒸发器(3)、第一流量控制器(4)、压缩机(5)、冷媒罐(6)连接，喷枪(1)的第二进口依次与超声雾化器(7)、第二流量控制器(8)、蠕动泵(9)、纤维蛋白原储存罐(10)连接，所述三通阀(2)与所述纤维蛋白原储存罐(10)连接；

所述步骤S3纤维蛋白原包被的具体步骤为：

S3-1：将所述喷涂装置按顺序连接；

S3-2：开启喷枪(1)和第一流量控制器(4)对羊膜基底膜表面降温至4-8℃，冷媒流量控制在0.2-0.5mL/s，完成预冷，随后开启第二流量控制器(8)，纤维蛋白原流量控制在0.01mL/s，使用喷枪(1)将超声雾化后的纤维蛋白原均匀喷涂在羊膜基底膜表面，完成一次喷涂；

S3-3：调整纤维蛋白原流量为0.04-0.07mL/s，冷媒流量为0.1mL/s，继续使用喷枪(1)将超声雾化后的纤维蛋白原均匀喷涂在羊膜基底膜表面，完成二次喷涂；调整纤维蛋白原流量为0.04-0.07mL/s，打开三通阀(2)使冷媒通入纤维蛋白原储存罐(10)内，继续使用喷枪(1)将冷却并超声雾化后的纤维蛋白原均匀喷涂在羊膜基底膜表面，得到包被纤维蛋白原的羊膜基底膜。

2.根据权利要求1所述的一种包被纤维蛋白原的蓝染羊膜基底膜的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中培养基为Dulbecco改良版Eagle培养基DMEM。

3.根据权利要求1所述的一种包被纤维蛋白原的蓝染羊膜基底膜的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中蛋白链式反应包括HIV、乙肝、丙型肝炎、布鲁氏菌病、弓形虫病、巨细胞病毒和梅毒。

4.根据权利要求1所述的一种包被纤维蛋白原的蓝染羊膜基底膜的制备方法，其特征在于，所述步骤S2羊膜基底膜的台盼蓝染色具体步骤为：

S2-1-1：将羊膜基底膜浸泡在台盼蓝染色剂中3-5min；

S2-1-2：将浸泡后的羊膜基底膜取出浸泡在灌注液中3-5min；

S2-1-3：将染色后的羊膜基底膜在32-35℃无菌条件下烘干处理。

5.根据权利要求1所述的一种包被纤维蛋白原的蓝染羊膜基底膜的制备方法，其特征在于，所述步骤S2羊膜基底膜的亮蓝染色具体步骤为：

S2-2-1：将羊膜基底膜放置在无菌玻璃夹片中，在玻璃夹片内使用钝针头注入2-4mL亮蓝染色剂，静置3-5min；

S2-2-2：在玻璃夹片内注入空气挤出染色剂，随后注入灌注液置换出剩余的空气和染色剂，静置3-5min；

S2-2-3：将染色后的羊膜基底膜在32-35℃无菌条件下烘干处理。