[发明专利]一种外泌体透射电镜样品制作方法

说明书

本发明涉及一种外泌体透射电镜样品制作方法，代替传统的制样方式，可以利用微量外泌体悬液制备透射电镜样品，同时不会妨碍外泌体的形态学的观察；将外泌体与固定液混合液滴于载体上，取疏水膜覆盖，静置后弃疏水膜，负染后即得到待测样品。本发明的有益效果是：制样方法对外泌体要求较低，不限外泌体来源，不限外泌体溶液纯化方式和纯度，具有较广的检测范围，最大限度保留滴至载体上的外泌体样本，低浓度或微量检测也能够获得较佳图像；与传统制样方法比较，即便其使用量仅为传统制样的1/25，也能够不改变外泌体的形态，不妨碍外泌体的形态学的观察。

技术领域

本发明涉及一种外泌体透射电镜样品制作方法。

背景技术

外泌体(exosomes)是一种直径在30-150nm之间的茶托型结构的小囊泡，包含RNA、蛋白质、microRNA、DNA片段等多种成分。全部真核细胞和一些原核细胞均可分泌，主要分布在血液、唾液、尿液、羊水和母乳等多种体液中。它是由细胞质膜内陷形成早期的核内体，核内体内陷包裹物质形成多泡体，而后多泡体在与质膜融合后得以释放。尽管外泌体早在1983年就被发现，但当时人们普遍认为它是细胞代谢的废弃物，主要作用是在新陈代谢过程中承担扔废料的角色。然而2007年，研究人员发现外泌体含有母细胞来源的蛋白、脂质和核酸，并能作为信号分子传递其他细胞从而改变靶细胞功能。随着研究结果的不断发现，把外泌体研究与转化研究推向了新的时代。

外泌体表征中形态学是关键指标，而最常使用的设备是投射电子显微镜。外泌体传统的透射电镜的制样方式来源国际细胞外囊泡协会(International Society forExtracellular Vesicles， ISEV)发布的MISEV2014和MISEV2018两版指南。传统的透射电镜制样方式：外泌体悬液滴至带有碳膜的铜网上，静止后，吸水纸吸掉多余的液体，最后使用醋酸双氧铀负染、干燥、拍照。由于纯度高的外泌体悬液得来不易，在上述制样方法中，制样过程中吸水纸吸掉大量样本；如若减小样本后体积和降低样本浓度又得不到很好的形态学的结果。如蔺萌发表的文章《外泌体透射电镜样品的制备方法》所提到的，也是相同的制样方法，文中检测外泌体浓度在5×10¹¹/ml左右的悬液，分别对其进行5倍，10倍和20倍的稀释，高倍稀释后外泌体数量会变少，严重影响对外泌体形态的观察。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种外泌体透射电镜样品制作方法，代替传统的制样方式，可以利用微量外泌体悬液制备透射电镜样品，同时不会妨碍外泌体的形态学的观察。

本发明采用的技术方案是：一种外泌体透射电镜样品制作方法，将外泌体与固定液混合液滴于载体上，取疏水膜覆盖，静置后弃疏水膜，负染后即得到透射电镜样品。

优选地，具体操作方式如下：

将外泌体悬液和固定液混合，室温固定；

将混合液滴于载体上，取疏水膜覆盖在混合液滴上，静置后弃疏水膜；

对载体上留下的外泌体样本进行负染、干燥，即获得透射电镜样品。

优选地，疏水膜为聚偏氟乙烯(PVDF)、聚乙烯(PE)、聚氯乙烯(PVC)、parafilm膜或铜网。

优选地，固定液为4%PFA，外泌体悬液与固定液等比例混合。

优选地，固定时间为10-20min。

优选地，覆盖疏水膜后静置时间为10-20min。

优选地，使用2%醋酸双氧铀进行负染。

优选地，载体为铜网。