[发明专利]一种尼克酰胺磷酸核糖转移酶的提取纯化方法

权利要求书

1.一种尼克酰胺磷酸核糖转移酶的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将NAMPT生产菌株进行发酵培养，得到发酵液，离心，收集发酵液中的菌体；

(2)向菌体中加入纯水，每1g菌体中加入999g水，用氨水调节pH至7.2-7.4，过均质机后离心，均质压力15,000PSI，均质流量400L/Hr，离心速度10000r/min，离心20min，分离得到上清液；

(3)将上清液依次经活性炭脱色和陶瓷膜过滤处理，陶瓷膜的孔径是100nm，过滤压力0.5MPa，得到滤液；

(4)向滤液中加入非离子型去垢剂Triton X-100和氯化钠，使Triton X-100的终质量浓度为2％，氯化钠的终浓度为500mM，去除包涵体，得到粗酶液；

(5)将粗酶液采用镍柱进行亲和层析，结合缓冲液是50mM的PBS，洗脱剂是80mM的咪唑磷酸盐缓冲液，洗脱剂的用量为5倍柱体积，流速为2L/min，收集洗脱液，洗脱液经电渗析脱盐后浓缩结晶，干燥，即提取纯化得到NAMPT；

步骤(1)中，所述NAMPT生产菌株由如下方法构建而成：

将SEQ ID NO.1所示的编码NAMPT的核苷酸片段连入质粒pLLP-ompA，获得第一重组表达载体；将SEQ ID NO.2所示的编码PARP1的核苷酸片段连入质粒pET-42a(+)，获得第二重组表达载体；再将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入大肠杆菌，即构建得到NAMPT生产菌株；

步骤(1)中，发酵培养的条件为：初始发酵温度为32-34℃，搅拌转速为200-400rpm，发酵过程中控制溶氧为20-40％，pH值为6.8-7.2；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.18-0.20；

将发酵体系的温度降至21℃-23℃，加入IPTG，使IPTG在发酵体系中的终浓度为0.5mmol/L；同时流加补料，所述补料由甘油和水按体积比1:1配制而成，补料的加入量为发酵培养基重量的10-20％，调控补料的流加速度使发酵体系的溶氧控制在20-40％，诱导培养20-30h，得到发酵液；

所述发酵培养基的组成为：甘油10g/L，酵母浸膏8g/L，氯化钠3g/L，硫酸铵2.5g/L，三水磷酸氢二钾4g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，柠檬酸2.1g/L，蛋白胨12g/L，七水硫酸镁0.5g/L。